付着性のセルのターゲット婚約を定量化するイメージングの高いコンテンツを使用してください。
Summary
薬のターゲットの関与の測定、効果的な薬の開発と妥当性化学プローブの中心。ここでは、我々 は携帯電話熱シフト試金 (CETSA) のマイクロ プレート互換適応高コンテンツ イメージングを用いた創薬ターゲット婚約を測定するためのプロトコルを詳しく説明します。
Abstract
目的の蛋白質ターゲットと小分子の相互作用を量的に表わす創、ターゲットの検証および化学プローブ検証にとって重要です。蛋白質ターゲットまたは小さい分子のままこの現象の測定方法は、技術的には難しいと思う特に貴重です。細胞熱シフト試金 (CETSA) は、細胞内のターゲットの関与を監視する技術のひとつです。ここでは、単一細胞レベルでの細胞内局在化を維持しながら高いスループット測定できますオリジナルの CETSA プロトコルの適応について述べる。このプロトコルは CETSA の化合物ターゲット相互作用、特に細胞の異種個体集団の詳細な特性評価申請に重要な進歩を提供するいますと考えています。
Introduction
開発新薬や化学プローブ ターゲット占有または生きているセル1,2,3への関与の測定と観察された薬理効果や機能的な読み出しをカップルが不可欠です。これらのデータが小分子実際に目的のターゲットに達することを確認して蛋白質ターゲット選択4、5の背後にある生物学的仮説を検証するために必要です。さらに、医薬品開発の間には複雑化のモデル システムは選択し、臨床試験の前に化合物鉛を裏付けるにされます。これらの前臨床システムの生物学の翻訳を確認するための創薬ターゲットの関与をトレースと付随するこの開発プロセス全体を通じて生物学の方法が重要です。
創薬ターゲット婚約伝統的 unfunctionalized 小分子や蛋白質、特に空間分解能6、7の単一細胞レベルで生きた細胞を監視するために挑戦されています。間の相互作用を観察する 1 つの最近の方法は、薬をそのまま、生きた細胞中のタンパク質は熱チャレンジへの応答でネイティブ蛋白質のリガンド誘導性の安定化、定量化された8、携帯電話熱シフト試金 (CETSA) 9,10。これが熱の挑戦への暴露後残りの可溶性タンパク質を定量化することでできます。CETSA の最初の開示、西部のしみの検出のため使用されました。早期発見キャンペーンを有効にし、大きい化合物コレクションのトリアージをヒット、CETSA 実験のスループットを増やすためにいくつか同種のマイクロ プレート ベースのアッセイ10,11の開発をリードしています。ただし、これらのメソッド 1 つの制限は、細胞懸濁液における化合物の治療に適しています現在最高検出セル換散、空間情報の損失につながるが必要です。CETSA がすることができます小さな分子の単一濃度または単一温度で蛋白質を安定させるために必要なリガンド濃度で実験加熱凝集温度 (Tagg) の配位子誘起シフトのいずれかとして適用します。後者は、等温線量応答指紋これら測定は特定の実験条件に依存性を示すために (ITDRF) と呼ばれます。
このプロトコルの目標は、付着細胞で CETSA を用いた高コンテンツ顕微鏡12蛍光 (IF) 抗体の検出のターゲットの関与を測定することです。この手順は、内局の保全とターゲットの関与の単一セルの定量化を可能にするのには、元の CETSA プラットフォームを拡張します。特に、多くの以前のレポートとは異なりこの手順では複合治療で実行されますライブの付着性のセル表面剥離有無により13の測定を目指して設立された結合平衡を保持熱挑戦前に洗濯。現在、メソッドは 1 つのターゲット蛋白質 p38α の検証 (MAPK14) のいくつかの細胞株、およびことこの手順を共有することによってテクニック広範に適用できる溶融プロテオームを越えてほしい。我々 は、このプロトコルはスクリーニングから医薬品開発パイプライン全体で合わせることができる、ターゲット婚約生体内での監視を通じてトリアージを見込んでいます。
Protocol
Representative Results
Discussion
結果のセクションで説明したように、方法は、いくつかのキー手順があります。まず、質の高い親和性の試薬を識別するために重要です。各ターゲットのための抗体の小さなライブラリをスクリーニングをお勧めします。一次抗体を選択すると、また適切な蛋白質ターゲットの異なる結合部位数のシステムを検証することが重要です。カウンター熱チャレンジを省略することによって<strong cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、ライフ研究所、カロリンスカ研究所の科学からインフラストラクチャのサポートを認めます。著者には、入力、ミカエラ Vallin、マグダレナ Otrocka とトーマス ・ Lundbäck との協議も認めます。
Materials
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Medicago | 09-9400-100 | |
| TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | for detaching cells and subculturing |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | fixative |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody | ThermoFisher Scientific | A11008 | secondary antibody |
| HCS CellMask Red stain | ThermoFisher Scientific | H32712 | Cytoplasm stain |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | 56741 | for permeabilization |
| Hoechst stain 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | nuclear stain |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) – high Glucose | Sigma-Aldrich | 6429 | cell culture media component |
| Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | cell culture media component |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | cell culture media component |
| Corning, breathable plate seal | Sigma-Aldrich | CLS3345 | for copound incubation step |
| Rabbit anti-p38 antibody [E229] | Abcam | ab170099 | primary antibody, LOT:GR305364-16 |
| Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates | VWR | 736-2044 | imaging plates |
| Greiner, 384-well low volume polypropylene plates | VWR | 784201 | |
| Adhesive aluminum foil | VWR | 30127790 | |
| Peelable aluminium seal | Agilent | 24210-001 | for PlateLoc |
| LY2228820 | Selleckchem | S1494 | p38α inhibitor |
| PH797804 | Selleckchem | PH797804 | p38α inhibitor |
| BIRB796 | Selleckchem | S1574 | p38α inhibitor |
| SB203580 | Tocris | 1202 | p38α inhibitor |
| AMG 548 | Tocris | 3920 | p38α inhibitor |
| RWJ 67657 | Tocris | 2999 | p38α inhibitor |
| L-Skepinone | CBCS compound collection | p38α inhibitor | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | blocking agent |
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | BDH | 44244 | used in antigen retrieval |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | used in antigen retrieval |
| A-431 cells | ATCC | ATC-CRL-1555 | |
| Echo 550 | Labcyte | For preparation of compound plates | |
| Plate sealer | Agilent | PlateLoc | |
| Bulk reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | Multidrop Combi |
| Automated liquid handling | Agilent | Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation | |
| Plate washer | Tecan | Hydrospeed | |
| Water bath | Julabo | TW12 | |
| Thermocouple | VWR | Thermocouple traceable lab thermometer | |
| High content imager | Molecular Devices | ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System |
References
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