Denna artikel beskriver en ny metod för att generera tumörantigen-specifika inducerad pluripotenta stamcells-härledda thymic emigranter (iTE) av en tredimensionell (3D) thymic kultur system. iTE är en homogen delmängd av T-celler nära besläktade med naiva T-celler med kapacitet för spridning, minnesbildning, och tumör dämpning.
Arvet från pre-omarrangerade T cellreceptorer (TCRs) och deras epigenetiska föryngring göra inducerad pluripotenta stamceller (iPSC)-härledda T-celler en lovande källa för adoptiv T cellterapi (ACT). Emellertid, klassiska in vitro-metoder för att producera regenererad t-celler från IPSC resultera i antingen innate-liknande eller obotligt differentierade t-celler, som är fenotypiskt och funktionellt skiljer sig från naiva t-celler. Nyligen, en roman tredimensionell (3D) thymic kultur system utvecklades för att generera en homogen delmängd av CD8αβ+ antigen-specifika T-celler med en naiv t cell-liknande funktionell fenotyp, inklusive kapacitet för spridning, minnesbildning , och tumörsuppression in vivo. Detta protokoll undviker avvikande utvecklings öden, vilket möjliggör generering av kliniskt relevanta iPSC-härledda T-celler, betecknade som iPSC-härledda thymic emigranter (iTE), samtidigt som det ger ett kraftfullt verktyg för att belysa de efterföljande funktioner som krävs för T cells mognad efter thymic Selection.
Adoptiv T cellterapi (ACT) kan vara en effektiv behandling för vissa patienter med avancerad cancer. Tyvärr, många patienter upplever inte tumörregression, och överförda celler inte kvarstår efter infusion. Detta kan bero på kvaliteten på de infunderade T-cellerna. En ACT musmodell visade att jämfört med naiva eller mindre differentierade centralminne T-celler, terminellt differentierade effektorceller är mindre potent på grund av dålig in vivo beständighet1, en observation också stöds av kliniska data2, 3.
I ett försök att förbättra effekten av nuvarande Act, t-cell-härledda inducerade pluripotenta stamceller (t-IPSC) har studerats utförligt4,5. När T-celler omprogrammeras till T-iPSC och omdifferentieras till T-celler, ärvs den omarrangerade konfigurationen av TCR-gener av T-iPSC, och därefter de re-differentierade T-cellerna. Därför, kapaciteten hos T-iPSC att genomgå obegränsad in vitro-expansion tillåter effektiv reproduktion av omogna T-celler som transporterar neoantigen-specifika T cellreceptorer (TCR) när sådana celler är konstruerade från tumörantigen-specifika T-celler6 ,7. Emellertid, den exakta metoden för differentiering av T-iPSC i mogna T-celler, vilket skulle tillåta produktion av cancer antigen-specifika T-celler med en mindre differentierad fenotyp och bättre anti-tumör potens, återstår att belysa.
T-IPSC differentiering sysselsätter Co-kulturen i OP9 murina stromaceller över-uttrycker mänskliga notch ligand DLL1 är en väl etablerad metod för att producera T-celler in vitro-6,7. Hos möss och människor kan detta medkultursystem konsekvent differentiera IPSC och därmed sammanfatta utvecklings händelser från blastocyststadiet till den omogna T-cellen Lineage Stage6,7. Trots dessa bioteknologiska framsteg, den fysiologiska differentieringen efter CD4+CD8+ dubbel positiva (DP) skede är fortfarande svårt att uppnå. En av anledningarna är att in vivo CD4+CD8-och CD4–CD8+ enda positiva (SP) T– celler genereras i brässen, ett organ som ansvarar för mognad och urval av T-celler som har utländsk antigen-specificitet men inte automatisk reaktivitet8. Dessa selektiva processer definieras som positiva respektive negativa val. Emellertid, de flesta av de molekylära mekanismer som krävs för att mogna T-celler i brässen är fortfarande inte helt klarlagda, vilket gör det svårt att rekonstruera denna process in vitro-. I ett försök att övervinna detta fysiologiska hinder, flera grupper har stimulerat TCR komplexet med anti-CD3 antikroppar eller agonist peptider. Dessa in vitro-tekniker generera cellprodukter som uttrycker nyckel T cell markörer, som CD3, CD8αβ, TCRαβ, och CD62L, samtidigt behålla tumörantigen-specificitet. Tyvärr, T-celler som genereras av dessa extrathymic metoder utgör en bred heterogen population av celler som kännetecknas av ofullständig positivt urval, medfödda-liknande funktioner, TCR icke-specifik avlivning, oförmåga för minnesbildning, och icke-ihållande anti-tumöreffekter in vivo8,9,10,11. Dessa avvikelser har väckt farhågor om att sådana celler kan utlösa en mängd biverkningar, inklusive lymfom och både hud och ben avvikelser, om de används för terapeutiska tillämpningar12,13,14 .
För att återskapa fysiologiska signaler saknas i nuvarande in vitro differentiering system, var tumörantigen-specifika T-iPSC differentierade med hjälp av en skördad Thymus. Den klassiska fostrets tymus orgel kultur (ftoc) system, som utformades för att studera intra-thymic utveckling av t-celler, förbättrades med hjälp av en 3D-kultur system som framgångsrikt producerade t-celler som genomgått thymic utbildning. Dessa post-thymic T celler, som utsågs till iPSC-derived thymic emigranter (iTE), uppvisade naiva-liknande egenskaper15. iTE visade proliferation, minnesbildning, och adekvat anti-tumör effekter i en musmodell mot etablerade B16 melanomtumörer. Denna artikel beskriver i detalj protokollet av denna roman FTOC system med hjälp av en 3D-kultur system (figur 1).
Med hjälp av T-iPSC att förnya tumörantigen-specifika T-celler kan övervinna många av de nuvarande hindren för ACT genom att generera unga celler med förbättrad uthållighet. Även om flera metoder med hjälp av OP9/DLL1 Co-Culture systemet har rapporterats att generera CD8 SP celler6,7,10,13 att uttrycka CD8 molekyler och tumörantigen-specifika TCRs, global gen uttrycksmönster och funktionell analys visar att dessa extrathymically regenererade CD8 SP celler skiljer från naiva T-celler (figur 4). Här beskriver vi en 3D thymic kultur system som kan generera IPSC-derived thymic emigranter (iTE) med hög trohet och homogenitet från murina T-IPSC. iTE likna naiva T-celler i globala gen uttrycksmönster och i funktionalitet, såsom minnesbildning och in vivo anti-tumör effekt mot etablerad tumör15.
Den klassiska FTOC systemet är ett sätt att recapitulate thymic urval in vitro-. Det har använts för att studera intra-thymic utveckling av tymocyter23, och det finns några rapporter om ftoc används för att generera RTE24. FTOC-systemet har dock flera begränsningar. För att hantera bristen på syre i en konstgjord orgel kultur, flera grupper har använt antingen en semi-torr membran baserad kultur23, eller hög syre nedsänkning kultur system25. Emellertid, inga nuvarande metoder kan ständigt generera en homogen population av post-thymic T celler. För att övervinna begränsningarna i den klassiska FTOC systemet, designade vi en 3D thymic kultur system som ger tekniska förbättringar jämfört med konventionella metoder15. Till exempel, med hjälp av vår 3D thymic kultur metod, maximal syre utbyte och avsaknaden av ytlobe mekanisk stress hålla thymic loberna i en mer fysiologisk miljö. Dessutom, långsiktig kultur tillåter mogna T-celler att utgående naturligt från thymic loberna. Slutligen, realtid observation och mikro-manipulation möjliggöra Media utbyte och en ständig samling av iTE utan att fysiskt störa thymic loberna. Sålunda, den 3D thymic kultur metod skaffar betydande teknisk förbättringarna likaledes så en aveny till studera thymically valde naiva T-cellerna så pass var inte tidigare tillgänglig.
Det finns flera viktiga punkter för den framgångsrika generationen av iTE använder denna 3D thymic kultur system. Kvaliteten på FBS och kultur villkor är avgörande för att bibehålla utbyggnaden av OP9/DLL1 celler utan att förlora sin förmåga att stödja iPSC differentiering. Därför rekommenderar vi förhandsutvärdering av FBS Lot samt genomgående passaging på 80% confluency för att förhindra celldifferentiering och senescence. Dessutom krävs en konfluenta OP9/DLL1 kultur för in vitro differentiering av IPSC i omogna T-celler, eftersom skillnader i sammanflödet kan påverka deras effektivitet. Slutligen är den embryonala åldern av thymic lober avgörande för generering av iTE. Vi rekommenderar att du använder E 14.5-15,5 thymic lobes.
Som med alla nya protokoll, denna metod har begränsningar och är föremål för förbättringar. Den kultur teknik som presenteras här genererar cirka 1000 iTE per thymic LOB per dag under en period av två veckor. Ökad iTE generation kan vara möjligt med ytterligare ändringar, inklusive optimering av syrekoncentration, media volym, och typ av 3D-kultur plattan. Tillägg eller avlägsnande av cytokiner, liksom förändringar i cytokin koncentration, kan också bidra till förbättrad iTE avkastning.
Med tanke på att 3D thymic kultur system som presenteras här kan generera thymic emigranter i ett helt ex vivo -system, denna teknik kan tillämpas på en mängd olika immunologiska och adoptiv cell överföring forskningsprojekt inklusive, men inte begränsat till T celldifferentiering, efter thymic T cell mognad, och generering av antigen-specifika T-celler från hematopoietiska stamceller. Även om denna metod inte är direkt tillämplig på mänskliga prover, iTE och 3D thymic kultur systemet har stor potential för att belysa de molekylära mekanismerna för positivt och negativt urval och kan underlätta skapandet av ett kultur system som gör det möjligt generering av kliniskt relevanta tumörantigen-specifika naiva-liknande T-celler för ACT.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Hiroshi Kawamoto och Kyoko Masuda för vänligt tillhandahållande av OP9/DLL1 cellinjer. Vi tackar Alan B. Hoofring och Erina Z. Han för grafisk hjälp. Denna forskning stöddes av intramural forskningsprogram av US National Cancer Institute (ZIA BC010763) och cancer Moonshot program för centrum för cell-baserad terapi vid NCI, NIH. Arbetet stöddes också av Milsteins familjestiftelse.
Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
2-deoxyguanosine | Sigma-Aldrich | 312693-72-4 | |
2-Mercaptoethanol (1000X) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A8960 | |
Blasticidin | Thermo Fisher Scientific | R21001 | |
FBS | Gemini | 100-500 | |
Flt-3 ligand | R&D Systems | 427-FL | |
GlutaMAX (100X) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
hgp100 | Genscript | 282077-1, KVPRNQDWL | |
Interleukin-2 | R&D Systems | 402-ML | |
Interleukin-7 | R&D Systems | 407-ML | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
MEM powder | Gibco | 61100061 | |
Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M-6145 | |
Nucleoprotein | Global Peptides | ASNENMETM | |
Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Phosphate buffered saline pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
Sodium Pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
Stem Cell Factor (SCF) | R&D Systems | 455-MC | |
Stemfactor LIF, Mouse Recombinant | STEMGENT | 03-0011-100 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 | |
Cell Culture Vessels and others | |||
10 cm dish | Corning, Inc. | 353003 | |
12ML Syringe | Covidien Monoject | 22-652-090 | |
6 well plate | Corning/Coster | 3516 | |
Cell strainer 100um | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
Cell strainer 40um | Fisher Scientific | 22-363-547 | |
Forceps | DUMONT | 0108-5PO | |
Lab soaker mat | Versi-Dry | Cat. EF2175CX 74018-00 | |
Membrane filters ( 0.8 μm, 47diam) | Whatman | WHA7408004 ALDRICH | |
Perfecta3D Hanging Drop Plate | Sigma-Aldrich | HDP1096 | |
U Bottom 96 well plate | Corning/Coster | 3799 | |
Experimental Cell lines | |||
CD3-iPSC | Vizcardo et al., Cell Report 2018 | N/A | |
MEF-iPSC | Vizcardo et al., Cell Report 2018 | N/A | |
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | ATCC | SCRC-1040; RRID:MGI:5007926 | |
OP9/N-DLL1 | Riken Bioresource center | Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220 | |
Pmel-iPSC | Vizcardo et al., Cell Report 2018 | N/A | |
Experimental mouse models | |||
B6.SJL-PtprcaPepcb/BoyCrCrl | Charles River | Strain Code 564; RRID:IMSR_CRL:564 | |
C57BL/6N | NCI/Charles River | N/A | |
Pmel-1 mice | Overwijk et al. | J Exp Med 198(4):569-80 | |
Antibodies | |||
Anti-aTCR | Biolegend | 109202; RRID:AB_313425 | |
Anti-CD3 | abcam | ab11089; RRID:AB_369097 | |
Anti-CD4 | BD Biosciences | 553730; RRID:AB_395014 | |
Anti-CD44 | BD Biosciences | 559250; RRID:AB_398661 | |
Anti-CD45.1 | BD Biosciences | 553775; RRID:AB_395043 | |
Anti-CD45.2 | BD Biosciences | 553772; RRID:AB_395041 | |
Anti-CD62L | BD Biosciences | 560516; RRID:AB_1645257 | |
Anti-CD69 | BD Biosciences | 552879; RRID:AB_394508 | |
Anti-CD8a | BD Biosciences | 557959; RRID:AB_396959 | |
Anti-CD8b | BD Biosciences | 550798; RRID:AB_393887 | |
Anti-H-2Kb | BD Biosciences | 553570; RRID:AB_394928 | |
Anti-IFN-g | BD Biosciences | 557998; RRID:AB_396979 | |
Anti-IL-2 | BD Biosciences | 554428; RRID:AB_395386 | |
Anti-TCRb | Thermo Fisher Scientific | 35-5961-81; RRID:AB_469741 | |
Anti-TCRVb13 | BD Biosciences | 553204; RRID:AB_394706 | |
Anti-TNFa | BD Biosciences | 557644; RRID:AB_396761 |