Detta stegvisa protokoll ger en detaljerad beskrivning av experiment och dataanalys för bedömning av inflammatoriskt svar i hiPSC-ECs och analys av leukocyt vidhäftning under fysiologiska flöde.
Endotelceller (ECs) är viktigt för regleringen av inflammatoriskt svar genom att begränsa eller att underlätta leukocyt rekrytering till drabbade vävnader via en välkarakteriserad kaskad av Pro självhäftande receptorer som är uppreglerad på den leukocyt cellytan vid inflammatoriska utlösaren. Inflammatoriskt svar skiljer sig mellan individer i befolkningen och den genetiska bakgrunden kan bidra till dessa skillnader. Mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) har visat sig vara en pålitlig källa till ECs (hiPSC-ECs), som alltså representerar en obegränsad källa av celler som fångar den genetiska identiteten och eventuella genetiska varianter eller mutationer av givaren. hiPSC-ECs kan därför användas för modellering inflammatoriskt svar i givare-specifika celler. Inflammatoriskt svar kan modelleras genom att bestämma leukocyt vidhäftning till de hiPSC-ECs under fysiologiska flöde. Detta stegvisa protokoll ger en detaljerad beskrivning av experiment och dataanalys för bedömning av inflammatoriskt svar i hiPSC-ECs och analys av leukocyt vidhäftning under fysiologiska flöde.
Inflammation spelar en nyckelroll i många sjukdomstillstånd, inklusive kardiovaskulära och neurodegenerativa sjukdomar, sepsis och biverkningarna reaktioner (ADRs). Endotelceller (ECs) spelar en viktig roll i regleringen av inflammatoriskt svar via induktion av Pro självhäftande receptorer, såsom E-selektin, intercellulära celladhesionsmolekyl-1 (ICAM-1 och andra) och vaskulär celladhesionsmolekyl-1 (VCAM-1) på deras yta 1 , 2. mikrovaskulära ECs i olika vävnader är kända för att uppvisa heterogenitet i inflammatoriskt svar3,4. Dessutom kan genetisk bakgrund eller vissa genetiska förhållanden leda till skillnader i inflammatoriskt svar mellan individer; Det är därför viktigt att ha tillgång till ECs från olika individer. Mer nyligen, mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs)5, som kan härledas från praktiskt taget alla individ, visades att fungera som en pålitlig och förnyelsebar källa av ECs6,7,8, 9. därför bedömningen av inflammatoriskt svar och leukocyt rekrytering i hiPSC-ECs är värdefulla, inte bara för modellering av vissa genetiska sjukdomar, men också att ge indikationer på interindividuell variabilitet och använda som ett verktyg för personlig medicin i framtiden.
Flöde-analyser ger ett användbart verktyg för att studera endothelial-leukocyt interaktion. Framsteg i ultrakalla enheter möjliggöra reproduktion av fysiologiska strömningsförhållanden med exakt kontroll av vaskulära säng-specifika shear stressnivåer. Levande imaging tillåter övervakning av kaskaden av händelser av leukocyt capture, rulla, krypa, adhesion och migration. Flera flöde analyser att studera endothelial-leukocyt interaktion har utvecklats, men de alla använder primära ECs10,11,12,13. Här beskriver vi i detalj analysen för bedömningen av humant leukocyt vidhäftning till hiPSC-ECs under fysiologiska flöde. I den här proceduren beskriver vi optimerade villkor för hiPSC-EG stimulering med pro-inflammatoriska stimuli, såsom tumörnekrosfaktor alfa (TNFα), dissociation, sådd i en mikroflödessystem chip med åtta parallella kanaler. Vi beskriva ett stegvisa protokoll för perfusionen i hiPSC-ECs med upphävandet av fluorescently märkta leukocyter i ultrakalla marker, live cell imaging och automatiserad inventering av vidhäftande leukocyter.
Detta protokoll är användbara för bedömning av inflammatoriskt svar i hiPSC-ECs i drogkontroll, sjukdom modellering och personlig regenerativ medicin.
Det här protokollet beskriver karakterisering av hiPSC-EG behandling med pro-inflammatoriska stimuli, såsom TNFα, funktionell bedömning av leukocyt vidhäftning till hiPSC-ECs i flödet analysen använder levande imaging och automatiserad inventering av vidhäftande leukocyter.
Övernattning stimulering av hiPSC-ECs med TNFα resulterar i den avlånga utseende som anger vanligtvis en aktiverad pro-inflammatoriska fenotyp i ECs. Under optimering, uttryck nivåer av E-selektin, ICAM-1, VCAM-1 bör kontrolleras av FACs7,8, och primära mänskliga navel ven ECs (HUVECs) är tillrådligt att inkluderas som positiva kontroller.
Optimala hiPSC-ECs dissociation och seedning densitet bör uppnås för att uppnå en konfluenta enskiktslager utan att bilda cell klumpar och kanalisera träskor. Det är viktigt för återsuspendering leukocyter precis innan perfusion för att undvika cell nederbörd och behålla en konstant koncentration när testmetoder varje kanal. Människans perifera leukocyter, såsom monocyter och neutrofiler kan användas, eller etablerat monocytic cellinjer, såsom THP-1 eller HL-60 kan användas som ett alternativ.
Vid montering av mikrofabricerade setup och under flöde analysen är det kritiskt för att undvika luftbubblor från att bli instängd i ultrakalla slangar och kanaler eftersom de kan resultera i avskildheten av hiPSC-ECs eller fastsittande leukocyter. Vätska-till-fluid gränssnitt eller inkorporering av ytterligare tvätt steg under utarbetandet av mikrofabricerade setup kunde hjälpa för att förhindra luftbubblor.
Det är tillrådligt att protokollet drivs av två aktörer där förbereder en cellerna och andra förbereder mikroflödessystem system och flöde analysen. Detta säkerställer att ECs är klädd i ultrakalla marker inom en konstant tidsfönster före bearbetning och förbättrar noggrannheten och reproducerbarheten för resultaten. Dessutom, tillåter detta också att inrätta blindad experiment för att undvika bias i resultaten.
För framgångsrik cell detektering med automatiserad bildbehandling rörledning, är det viktigt att förvärva bilder i fokus med högt signal-brus-förhållande och undvika autofluorescens av icke-specifika objekt, till exempel cell klumpar. Av avgörande betydelse är den rätt specifikationen av minimum- och maximumvärde gränserna för typiska storleken av vidhäftande leukocyter som måste identifieras. Man kan uppskatta leukocyter med en rad mätverktyg i ImageJ typisk storlek. Till exempel i vår analys använde vi spänna av 9 – 15 pixlar vilket motsvarar den fysiska storleken på 10,3 – 17,1 µm (figur 4 c). När du använder ett fel intervall, t.ex., 3-15 pixlar (3,4 – 17,1 µm), en enda leukocyt identifieras inte som en cell, men snarare dess kapitlen identifieras som separata objekt (figur 4 d). Detta leder till falskt antalet objekt identifieras.
Många föremål av en låg intensitet och mindre yta än leukocyter kan upptäckas med hjälp av medföljande adaptiv tröskelvärde metoden. Detta kan ta plats på grund av autofluorescens eller några andra icke-specifika fluorescerande signaler. Ändå, dessa icke-specifika objekt, om deras område är lägre än det typiska området av en enda leukocyt, kan filtreras genom att definiera minimalt accepterade ytan (figur 4 c).
Flöde analysen beskrivs här tillåter direkt bedömning av leukocyt vidhäftning till en EG enskiktslager, belysa samspelet mellan dessa två cell typer, men tar inte hänsyn till andra cell typer, såsom pericyter som är närvarande i kärlväggen och kanske också delta i regleringen av leukocyt extravasering15. Integrera en 3D kultur närmiljön med andra celltyper kan förbättra den fysiologiska betydelsen av systemet. Trots dessa begränsningar ger flöde analysen för bedömningen av inflammatoriskt svar som beskrivs här ett värdefullt verktyg för grundläggande karakterisering och sjukdom modellering program hiPSC-ECS.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill erkänna de följande bidrag: Europeiska forskningsrådet (ERCAdG 323182 STEMCARDIOVASC); Nederländerna orgel-on-Chip initiativ, en NWO Gravitation projekt finansierat av ministeriet för utbildning, kultur och vetenskap av regeringen av Nederländerna (024.003.001).
Vena8 Endothelial+ biochip | Cellix Ltd | V8EP-800-120-02P10 | |
Mirus Evo Nanopump | Cellix Ltd | MIRUS-EVO-PUMP | 1 x syringe pump; 1 x VenaFluxAssay Software; 1 x tubing kit; power supply and cables. |
8-channel manifold MultiFlow8 | Cellix Ltd | MIRUS-MULTIFLOW8 | |
Humidified box | Cellix Ltd | HUMID-BOX | |
Fluorescence imaging system Leica AF6000 | Leica Microsystems | ||
Electron-multiplying charge-coupled device camera | Hamamatsu | C9100 | |
Biological safety cabinet/laminar flow-hood | Cleanair | ||
CO2 cell-culture incubator | Panasonic | MCO-170AICUV | |
Centrifuge | Hitachi | himac-CT6EL | |
Handheld pipetman (P-10 (10 mL), P-200 (200 µL), P-1000 (1,000 µL) | Gilson international | 4807 (10µl), 4810 (200µl), 4809 (1000µl) | |
Sterile plastic pipette | Greiner Bio-One | 606180 (5ml), 607180 (10ml) | |
Petri dish | VWR/ Duran Group | 391-0860 | |
Culture flasks (75 cm2) | CELLSTAR | 658,170 | |
Centrifuge tube (15 mL) | CELLSTAR | 188271 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
Fibronectin (Bovine plasma) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-169 | |
Human Endothelial-SFM | Life Technologies | 11111-044 | |
Human VEGF 165 IS, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-109-386 | |
Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-842 | |
Platelet-poor Plasma Derived Serum, bovine | Biomedical Technologies | BT-214 | |
Recombinant Human TNF-α | Tebu-bio | 300-01A-A | |
TrypLE Select | Life Technologies | 12563029 | |
DiOC6(3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 21875-034 | |
2-Mercaptoethanol (50 mM) | Life Technologies | 31350010 | |
FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
L-glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Life Technologies | 15070-063 | |
Distilled water | Life Technologies | 15230-089 | |
Ethanol absolute | Merck | 1.00983.2500 | |
VCAM-1 | R&D systems | FAB5649P | |
E-Selectin | R&D systems | BBA21 | |
ICAM-1 | R&D systems | BBA20 | |
Name | Company | Software version | Comments |
Cellrofiler | CellProfiler | 2.1.1 | |
VenaFluxAssay Software | Cellix Ltd | 2.3.a |