Визуализация 3D белой жировой ткани структуры, с помощью окрашивания целом гора
Summary
В центре внимания настоящего исследования заключается в демонстрации целом гора иммуноокрашивания и визуализации метод как метод идеально подходит для 3D визуализация архитектуры и сотовых составляющей жировой ткани.
Abstract
Жировой ткани является важным органом метаболизма с высокой пластичностью и реагировать на экологические стимулы и питательный статус. Таким образом были разработаны различные методы для изучения морфологии и биологии жировой ткани. Однако обычные визуализации методы ограничены к изучению ткани в 2D разрезах, сумев захватить 3D архитектура весь орган. Здесь мы представляем в целом гора окрашивание, иммуногистохимия метод, который сохраняет нетронутыми жировой ткани морфология с минимальной обработки шагов. Следовательно без искажений, достижение наиболее представительных 3D визуализации тканей поддерживаются структуры адипоциты и других клеточных компонентов. Кроме того всего гора пятнать может сочетаться с линии методы трассировки для определения решения судьбы клетки. Однако этот метод имеет некоторые ограничения для предоставления точной информации в отношении более глубоких частях жировой ткани. Чтобы преодолеть это ограничение, окрашивание всей гора далее комбинируется с ткани, очистка методов для удаления непрозрачность ткани и полная визуализация анатомии всей жировой ткани с помощью флуоресцентной микроскопии свет лист. Таким образом более высокое разрешение и более точное представление о жировой ткани структуры могут быть захвачены с сочетанием этих методов.
Introduction
Жировой ткани является важным органом для хранения энергии и характеризуется динамической перепланировка и практически неограниченного расширения1. Помимо энергетического гомеостаза жировой ткани также играет важную роль в секреции гормона из более чем 50 адипокинов чтобы модулировать всего тела метаболические функции2. Жировая ткань имеет различные архитектуры, состоящий из различных типов клеток, включая пожилые адипоциты, фибробласты, эндотелиальные клетки, иммунные клетки и Адипоцит прогениторных клеток3. Недавние исследования показали, что ожирение и другие метаболические дисфункции может значительно изменить функции жировой ткани и ее микроокружения, которая включает, но не ограничивается расширения адипоциты, инфильтрация воспалительных клеток (например, макрофагов) и сосудистые дисфункции3.
Обычные Морфологические методы, такие как cryosectioning и гистологии продемонстрировать некоторые ограничения в изучении жировой биология таких продолжительных химической обработки шагов, которые могут привести к ткани усадки и структура искажения3, 4. Кроме того эти 2D методы недостаточны соблюдать межклеточных взаимодействий, оказываемое различных типов клеток, так как полученные разделы ограничены для небольших участков всей ткани3. По сравнению с обычными методами флуоресцентных изображений, окрашивание всей гора не требуют дополнительных инвазивных шаги, такие как встраивание, секционирование и обезвоживания; Таким образом это позволяет избежать проблемы уменьшения специфичность антитела. Таким образом это простой и эффективный метод для визуализации жировой ткани, с лучшей сохранности Адипоцит морфологии и структуре общей жировой ткани5. Таким образом всего гора окрашивание как метод быстрый и недорогой immunolabeling был создан для сохранения жировой ткани 3D архитектура1,6,,78.
Однако несмотря на сохранение жировой ткани морфологии с использованием всего гора окрашивание, этот метод все еще не удается визуализировать внутренней структуры под поверхностью липидов в ткани. Несколько недавних исследований9,10 установили очистка методов в сочетании с целом гора immunolabeling1,6 для всеобъемлющей 3D визуализации в жировой ткани. В частности плотной сети нервных и сосудистую были подробно освещены в последние исследования9,10,11,12 с визуализации 3D-объем. Действительно изучая пластичности нервной и сосудистой жировой ткани в различных физиологических условиях имеет важное значение для изучения его биологии. Immunolabeling с поддержкой трехмерных изображений очистки ткани растворителя очищены органов (iDISCO +) представляет собой процесс состоит из метанола предварительной обработки, immunolabeling и очистка непрозрачность ткани с органические химические реагенты Дихлорметан (DCM ) и dibenzyl эфира (DBE)13,14. Делая жировой ткани полностью прозрачным,9,10можно получить более точное представление об анатомии в ткани, такие как кровеносных сосудов и нервных волокон. IDISCO + имеет преимущества в том, что он совместим с различными антител и флуоресцентные журналистам11,14, и он продемонстрировал успех в различных органах и даже embryoes14. Однако его основным ограничением является длительный инкубационный время, в котором 18-20 дней, необходимых для завершения всего эксперимента.
Другое важное применение всего гора окрашивания является визуализация судьбы клеток в сочетании с системой трассировки линии. Родословная трассировки является маркировка конкретных генов/маркера в ячейке, может быть передан все клетки дочи и сохраняется в течение времени15. Таким образом он является мощным инструментом, который может использоваться для определения судьбы клетки потомства15. Начиная с 90-х годов, КРР-LoxP Рекомбинатные системы стало мощный подход для трассировки линии в живых организмов15. Когда мышь линию, которая выражает Cre, рекомбиназа фермента ДНК, пересекается с другой мыши линии, выражая репортером, которая примыкает к loxP стоп loxP последовательность, репортер белок является выраженным15.
Для окрашивания целом гора, использование флуоресцентных многоцветной Репортеры подходит для изображений из жировой ткани, потому что она позволяет для минимального вмешательства с внутриклеточной деятельности Адипоцит16. Однако традиционные репортерам обычно пятно цитоплазме, что делает его трудно проследить родословную белых адипоциты, которые имеют ограниченный цитоплазматических содержание17. Для преодоления этой проблемы, использование мембранных привязкой флуоресцентный tdTomato/мембраны eGFP (mT/мг) репортер маркер является идеальным инструментом. Ориентированные на мембране tdTomato выражается в Cre отрицательные клетки18. После иссечения Cre происходит переключение на выражение мембраны целевой eGFP, что делает этот репортер подходит для отслеживания lineage Адипоцит прародителями17,18 (Дополнительный рис . 1).
Цель этого документа должна предоставить подробный протокол для окрашивания целом гора и показать, каким образом оно может сочетаться с другими методами для изучения развития и физиологии жировой ткани. Двумя примерами приложений, описанных в настоящем Протоколе являются его использования с 1) многоцветная репортер мыши линий для выявления различного происхождения адипоциты и 2) ткани, очистка далее визуализировать нейронные арборизация в белой жировой ткани (Ват).
Protocol
Representative Results
Discussion
Хотя обычные методы, такие как cryosection и гистологии предлагают преимущества для наблюдения за внутриклеточные структуры, окрашивание всей гора предоставляет различные перспективы в исследованиях жировой ткани, что позволяет 3D визуализация сотовой связи Архитектура минимально обрабо?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась за счет грантов от естественных наук и инженерных исследований Совета (СЕНТИ) Канада, пилот и осуществимости исследования Грант Бантинг и лучший диабет центр (BBDC), Фонда SickKids Start-up H-K. S., медицинский исследовательский центр программы (2015R1A5A2009124) через национальных исследований фонда из Кореи (NRF) финансируется министерством науки, ИКТ и будущего планирования для J-р.к.
Materials
| LipidTox | Life Technologies | H34477 | |
| PECAM-1 primary antibody | Millipore | MAB1398Z(CH) | |
| TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody | Millipore | AB152, AB1542 | |
| DAPI stain | BD Pharmingen | 564907 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| Ultramicroscope I | LaVision BioTec | Light sheet image fluorescent microscope | |
| Alexa Fluor secondary antibodies | Jackson ImmunoResearch | Wavelengths 488, 594 and 647 used | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BioSciences | 553141 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dibenzyl-ether | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A452-1 | |
| 30% Hydrogen Peroxide | BIO BASIC CANADA INC | HC4060 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | J7126 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Lectin kit I, fluorescein labeled | VECTOR LABORATORIES | FLK-2100 | |
| F4/80 | Bio-Rad | MCA497GA | |
| VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI | VECTOR LABORATORIES | H-1500 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | |||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | |||
| Triton-X | |||
| Tween | |||
| Animal serum (goat, donkey) |
References
- Sung, H. K. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17, 61-72 (2013).
- Greenberg, A. S., Obin, M. S. Obesity and the role of adipose tissue in inflammation and metabolism. American Journal of Clinical Nutrition. 83, 461-465 (2006).
- Martinez-Santibañez, G., Cho, K. W., Lumeng, C. N. Imaging White Adipose Tissue With Confocal Microscopy. Methods in Enzymology. 537, 17-30 (2014).
- Laforest, S. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity (Silver Spring, MD). 25 (1), 122-131 (2017).
- Berry, R. Imaging of adipose tissue. Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).
- Kim, K. H. Intermittent fasting promotes adipose thermogenesis and metabolic homeostasis via VEGF-mediated alternative activation of macrophage. Cell Research. 27 (11), 1309-1326 (2017).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100 (4), e47-e57 (2007).
- Lee, J. H., Yeganeh, A., Konoeda, H., Moon, J. H., Sung, H. K. Flow Cytometry and Lineage Tracing Study for Identification of Adipocyte Precursor Cell (APC) Populations. Methods in Molecular Biology. 1752, 111-121 (2018).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation. in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
- Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues. Molecular Metabolism. , (2018).
- Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Whole-tissue 3D imaging reveals intra-adipose sympathetic plasticity regulated by NGF-TrkA signal in cold-induced beiging. Protein & Cell. 9 (6), 527-539 (2018).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).
- Vorhagen, S., et al. Lineage tracing mediated by cre-recombinase activity. Journal of Investigative Dermatology. 135 (1), 1-4 (2015).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- . iDISCO+ protocol Available from: https://www.idiscodotinfo.files.wordpress.com/2015/04/whole-mount-staining-bench-protocol-methanol-dec-2016.pdf (2016)
- Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. The Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
- Papadopulos, F., et al. Common tasks in microscopic and ultrastructural image analysis using ImageJ. Ultrastructural Pathology. 31 (6), 401-407 (2007).
- Stanly, T. A., et al. Critical importance of appropriate fixation conditions for faithful imaging of receptor microclusters. Biology Open. 5 (9), 1343-1350 (2016).
- Spalteholz, W. . Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: Über Knochenfärbung. , (1914).
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
