Visualisatie van 3D witte adipeus weefsel structuur met behulp van geheel-mount kleuring
Summary
De focus van de huidige studie is om aan te tonen van de gehele-mount immunokleuring en visualisatie techniek als een ideale methode voor 3D beeldvorming van vetweefsel architectuur en cellulaire component.
Abstract
Vetweefsel is een belangrijk metabolisch orgaan met hoge plasticiteit en inspelen op milieu stimuli en de status van de nutriënten. Als zodanig, zijn verschillende technieken ontwikkeld om te bestuderen van de morfologie en de biologie van vetweefsel. Conventionele visualisatie methoden zijn echter beperkt tot het bestuderen van het weefsel in 2D secties, niet te vangen de 3D architectuur van het gehele orgaan. Hier presenteren we geheel-mount kleuring, een immunohistochemistry methode die bewaart intact adipeus weefsel morfologie met minimale processing stappen. Vandaar, de structuren van adipocytes en andere cellulaire componenten worden gehandhaafd zonder vervorming, bereiken de meest representatieve 3D visualisatie van het weefsel. Geheel-mount kleuring kan bovendien worden gecombineerd met lineage tracering methoden ter bepaling van de cel lot besluiten. Deze techniek heeft echter enkele beperkingen aan het verstrekken van nauwkeurige informatie met betrekking tot de diepere delen van vetweefsel. Om deze beperking ondervangen kan geheel-mount kleuring worden verder gecombineerd met weefsel van het ontruimen van technieken om de ondoorzichtigheid van weefsel te verwijderen en te zorgen voor volledige visualisatie van hele adipeus weefsel anatomie met behulp van licht vel fluorescent microscopie. Dus kunnen een hogere resolutie en meer accurate weergave van vetweefsel structuren worden vastgelegd met de combinatie van deze technieken.
Introduction
Vetweefsel is een essentieel orgaan voor energieopslag en wordt gekenmerkt door de dynamische reorganisatie en bijna onbeperkte uitbreiding1. Naast energie homeostase speelt adipeus weefsel ook een essentiële rol in hormoon afscheiding van meer dan 50 adipokines te moduleren van gehele lichaam metabole functie2. Vetweefsel heeft een divers het platform bestaande uit verschillende celtypen, met inbegrip van volwassen adipocytes, fibroblasten, endotheliale cellen, immune cellen en adipocyte voorlopercellen cellen3. Recente studies hebben aangetoond dat overgewicht en andere metabole disfunctie aanzienlijk veranderen kunnen adipeus weefsel functie en de communicatie, die omvat, maar is niet beperkt tot uitbreiding van de adipocytes, infiltratie van ontstekingscellen (b.v., macrofagen), en vasculaire dysfunctie3.
Conventionele morfologische technieken zoals histologie en cryosectioning tonen verschillende beperkingen bij het bestuderen van obesitas biologie zoals lange chemische verwerking stappen, die tot weefsel krimp en structuur vervorming3leiden kan, 4. Bovendien, deze 2D technieken zijn onvoldoende om het observeren van intercellulaire interacties uitgeoefend door verschillende soorten cellen, zoals de secties verkregen beperkt tot kleinere regio’s van de gehele weefsel3 zijn. In vergelijking met conventionele methoden voor fluorescerende imaging, geheel-mount kleuring vereist geen extra invasieve stappen, zoals insluiten, afdelen en uitdroging; Dus, dit voorkomt het probleem van de afnemende antilichamenspecificiteit. Als zodanig is het een eenvoudige en efficiënte methode voor imaging adipeus weefsel, met beter behoud van de adipocyte morfologie en algehele adipeus weefsel structuur5. Daarom geheel-mount kleuring zoals een snelle en goedkope immunolabeling techniek werd opgericht voor het behoud van vetweefsel 3D het platform1,6,7,8.
Echter, ondanks het behoud van vetweefsel morfologie met gebruik van het geheel-mount kleuring, deze techniek is nog steeds niet in staat om te visualiseren van innerlijke structuren onder de oppervlakte van de lipide van het weefsel. Verschillende recente studies9,10 geconstateerd weefsel clearing technieken gecombineerd met geheel-mount immunolabeling1,6 te voorzien van uitgebreide 3D-visualisatie in adipeus weefsel. In het bijzonder zijn dichte neurale en therapieën netwerken gevisualiseerd in recente studies9,10,11,12 met 3D-volume imaging. Inderdaad, het bestuderen van de neurale en vasculaire plasticiteit van vetweefsel onder verschillende fysiologische omstandigheden is essentieel voor de studie van de biologie. Immunolabeling ingeschakelde driedimensionale beeldvorming van oplosmiddel-gewist organen (iDISCO +) weefsel clearing is een proces bestaat uit methanol voorbehandeling, immunolabeling, en ruimen van weefsel ondoorzichtigheid met organische chemische reagentia dichloormethaan (DCM ) en dibenzyl ether (DBE)13,14. Door het vetweefsel volkomen transparant te maken, kan een meer accurate weergave van anatomie binnen het weefsel zoals bloedvaten en neurale vezels worden verkregen9,10. IDISCO + heeft voordelen het is compatibel met verschillende antilichamen en fluorescerende verslaggevers11,14, en het heeft aangetoond dat succes in meerdere organen en zelfs embryoes14. De belangrijkste beperking is echter een lange incubatietijd, waarin 18 tot 20 dagen nodig om te voltooien van het hele experiment.
Een andere belangrijke toepassing van geheel-mount kleuring is de visualisatie van het lot van de cel in combinatie met een systeem voor de tracering van afkomst. Lineage tracering is de etikettering van een specifiek gen/markering in een cel die kan worden doorgegeven aan alle cellen van de dochter en over tijd15wordt behouden. Als zodanig is het een krachtig hulpmiddel dat kan worden gebruikt voor het bepalen van het lot van15nakomelingen van een cel. Sinds de jaren 1990, de Cre-LoxP recombinante systeem is uitgegroeid tot een krachtige aanpak voor lineage tracering in levende organismen15. Wanneer een muis-lijn die Cre, een DNA recombinase enzym uitdrukt, is gekruist met een andere muis lijn uiting van een verslaggever die grenst aan een reeks loxP-STOP-loxP, is het eiwit verslaggever uitgedrukt15.
Voor geheel-mount kleuring, is het gebruik van fluorescerend multicolor verslaggevers geschikt voor imaging van vetweefsel, omdat het zorgt voor minimale interferentie met intracellulaire activiteiten van de adipocyte16. Echter, traditionele verslaggevers meestal vlek het cytoplasma, waardoor het moeilijk is om te traceren van de bloedlijn van witte adipocytes, die weinig hebben cytoplasmatische inhoud17. Om dit probleem te verhelpen, is het gebruik van membraan-gebonden fluorescerende tdTomato/membraan eGFP (mT/mG) verslaggever marker een ideaal hulpmiddel. Membraan-gerichte tdTomato wordt uitgedrukt in Cre-negatieve cellen18. Op Cre excisie optreedt een schakelaar op de expressie van eGFP membraan-gerichte, waardoor deze verslaggever geschikt voor het traceren van de bloedlijn van adipocyte voorlopercellen17,18 (Aanvullende figuur 1).
Het doel van deze paper is te voorzien in een gedetailleerd protocol geheel-mount kleuring en tonen hoe het kan worden gecombineerd met andere technieken te bestuderen voor de ontwikkeling en de Fysiologie van vetweefsel. Twee voorbeelden van toepassingen die zijn beschreven in dit protocol zijn het gebruik ervan met 1) Multikleur verslaggever muis lijnen te identificeren van verschillende oorsprong van adipocytes en 2) weefsel wissen om de neurale arborization in witte vetweefsel (WAT) verder te visualiseren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hoewel conventionele technieken zoals histologie en cryosection voordelen bieden voor de observatie van intracellulaire structuur, biedt geheel-mount kleuring een ander perspectief in adipeus weefsel onderzoek, waarmee 3D-visualisatie van cellulaire architectuur van minimaal verwerkte weefsel.
Om het geheel-mount kleuring uitvoeren, moeten de volgende suggesties in aanmerking worden genomen. Verschillende adipeus weefsel depots kunnen verschillende immunokleuring resultaten opleveren; Dus, het…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de Natural Sciences and Engineering Research Raad (NSERC) van Canada, Pilot en haalbaarheid studie Grant Banting & beste Diabetes centrum (BBDC), het startfonds SickKids aan H-K. S., medische Research Center Program (2015R1A5A2009124) door de nationale onderzoek Stichting van Korea (NRF) gefinancierd door het ministerie van wetenschap, ICT en toekomst van plan om J-R.K.
Materials
| LipidTox | Life Technologies | H34477 | |
| PECAM-1 primary antibody | Millipore | MAB1398Z(CH) | |
| TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody | Millipore | AB152, AB1542 | |
| DAPI stain | BD Pharmingen | 564907 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| Ultramicroscope I | LaVision BioTec | Light sheet image fluorescent microscope | |
| Alexa Fluor secondary antibodies | Jackson ImmunoResearch | Wavelengths 488, 594 and 647 used | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BioSciences | 553141 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dibenzyl-ether | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A452-1 | |
| 30% Hydrogen Peroxide | BIO BASIC CANADA INC | HC4060 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | J7126 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Lectin kit I, fluorescein labeled | VECTOR LABORATORIES | FLK-2100 | |
| F4/80 | Bio-Rad | MCA497GA | |
| VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI | VECTOR LABORATORIES | H-1500 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | |||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | |||
| Triton-X | |||
| Tween | |||
| Animal serum (goat, donkey) |
References
- Sung, H. K. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17, 61-72 (2013).
- Greenberg, A. S., Obin, M. S. Obesity and the role of adipose tissue in inflammation and metabolism. American Journal of Clinical Nutrition. 83, 461-465 (2006).
- Martinez-Santibañez, G., Cho, K. W., Lumeng, C. N. Imaging White Adipose Tissue With Confocal Microscopy. Methods in Enzymology. 537, 17-30 (2014).
- Laforest, S. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity (Silver Spring, MD). 25 (1), 122-131 (2017).
- Berry, R. Imaging of adipose tissue. Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).
- Kim, K. H. Intermittent fasting promotes adipose thermogenesis and metabolic homeostasis via VEGF-mediated alternative activation of macrophage. Cell Research. 27 (11), 1309-1326 (2017).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100 (4), e47-e57 (2007).
- Lee, J. H., Yeganeh, A., Konoeda, H., Moon, J. H., Sung, H. K. Flow Cytometry and Lineage Tracing Study for Identification of Adipocyte Precursor Cell (APC) Populations. Methods in Molecular Biology. 1752, 111-121 (2018).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation. in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
- Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues. Molecular Metabolism. , (2018).
- Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Whole-tissue 3D imaging reveals intra-adipose sympathetic plasticity regulated by NGF-TrkA signal in cold-induced beiging. Protein & Cell. 9 (6), 527-539 (2018).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).
- Vorhagen, S., et al. Lineage tracing mediated by cre-recombinase activity. Journal of Investigative Dermatology. 135 (1), 1-4 (2015).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- . iDISCO+ protocol Available from: https://www.idiscodotinfo.files.wordpress.com/2015/04/whole-mount-staining-bench-protocol-methanol-dec-2016.pdf (2016)
- Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. The Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
- Papadopulos, F., et al. Common tasks in microscopic and ultrastructural image analysis using ImageJ. Ultrastructural Pathology. 31 (6), 401-407 (2007).
- Stanly, T. A., et al. Critical importance of appropriate fixation conditions for faithful imaging of receptor microclusters. Biology Open. 5 (9), 1343-1350 (2016).
- Spalteholz, W. . Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: Über Knochenfärbung. , (1914).
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
