Visualisierung von 3D weißen Fettgewebe Schachts ganz-Mount Färbung
Summary
Der Schwerpunkt der vorliegenden Studie soll die gesamte-Mount Immunostaining und Visualisierung Technik als eine ideale Methode für die 3D Darstellung von Fettgewebe Architektur und zellulären Komponente zeigen.
Abstract
Fettgewebe ist ein wichtiges Stoffwechselorgan mit hoher Plastizität und reagieren auf Reize aus der Umwelt und Nährstoff-Status. Als solche haben verschiedene Techniken entwickelt, um die Morphologie und Biologie des Fettgewebes zu studieren. Allerdings sind herkömmliche Visualisierungsmethoden beschränkt sich auf die Untersuchung des Gewebes in 2D-Schnitte, Nichtbeachtung die 3D Architektur des gesamten Organs zu erfassen. Hier präsentieren wir Ihnen ganze-Mount Färbung, eine immunhistochemische Methode, die intakt Fettgewebe Morphologie mit minimalen Bearbeitungsschritten bewahrt. Daher bestehen die Strukturen der Adipozyten und anderen zellulären Komponenten ohne Verzerrung, die repräsentativsten 3D-Visualisierung des Gewebes zu erreichen. Darüber hinaus ganz-Mount Färbung mit Abstammung-Tracing-Methoden zur Zelle Schicksal Entscheidungen bestimmen kombinierbar. Diese Technik hat jedoch einige Einschränkungen, die korrekte Information über tiefere Teile des Fettgewebes. Um diese Einschränkung zu umgehen, ganz-Mount Färbung weiter kombinierbar mit Gewebe clearing-Techniken, um die Undurchsichtigkeit der Gewebe zu entfernen und ermöglichen vollständige Visualisierung der gesamten Fettgewebe Anatomie mit Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie. Daher können eine höhere Auflösung und eine genauere Darstellung der Fettgewebe Strukturen mit der Kombination dieser Techniken erfasst werden.
Introduction
Fettgewebe ist ein wesentliches Organ zur Speicherung von Energie und zeichnet sich durch dynamische Umbau und fast unbegrenzte Erweiterung1. Neben Energie-Homöostase spielt Fettgewebe auch eine wesentliche Rolle in Hormonausschüttung von mehr als 50 Adipokine Ganzkörper-metabolische Funktion2zu modulieren. Fettgewebe hat eine vielfältige Architektur, bestehend aus verschiedenen Zelltypen, einschließlich Reifen Adipozyten, Fibroblasten, Endothelzellen, Immunzellen und Adipocyte Progenitor Zellen3. Jüngste Studien haben gezeigt, dass Fettleibigkeit und anderen Stoffwechselstörungen wesentlich ändern können, Fettgewebe Funktion und ihrer Mikroumgebung, die beinhaltet, aber beschränkt sich nicht auf die Erweiterung der Adipozyten, Infiltration von Entzündungszellen (z.B. Makrophagen), und vaskuläre Dysfunktion3.
Konventionelle morphologische Techniken wie Histologie und Kryoschneiden demonstrieren mehrere Einschränkungen bei der Untersuchung adipöser Biologie wie lange chemische Verarbeitungsschritte, Gewebe schrumpfen und Struktur Verzerrung3führen kann, 4. Darüber hinaus sind diese 2D Techniken nicht ausreicht, um interzelluläre Wechselwirkungen von verschiedenen Zelltypen ausgeübt zu beobachten, wie die Abschnitte bezogen auf das gesamte Gewebe3kleinere Regionen beschränkt sind. Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden der Fluoreszenz-Bildgebung, ganze-Mount Färbung nicht weitere invasive Schritte, z. B. einbetten, Schnitt und Dehydrierung erfordert; so, dies vermeidet das Problem der abnehmenden Antikörperbesonderheit. Als solches ist es eine einfache und effiziente Methode zur bildgebenden Fettgewebe mit besseren Schutz der Adipocyte Morphologie und insgesamt Fettgewebe Struktur5. Daher ganz-Mount Färbung wie eine schnelle und kostengünstige Immunolabeling-Technik gegründet wurde, um Fettgewebe 3D-Architektur1,6,7,8zu erhalten.
Trotz der Erhaltung der Fettgewebe Morphologie mit Nutzung der gesamten-Mount Färbung ist diese Technik jedoch noch nicht in der Lage, innere Strukturen unter der Lipid-Oberfläche des Gewebes sichtbar zu machen. Mehrere aktuelle Studien9,10 entstanden Gewebe clearing Techniken kombiniert mit ganz-Mount Immunolabeling1,6 , um umfassende 3D Visualisierung im Fettgewebe zu ermöglichen. Insbesondere wurden Dichte neuronale und Gefäßsystem Netze in den letzten Studien9,10,11,12 mit 3D-Volumen Bildgebung visualisiert. In der Tat ist es wichtig, seine Biologie zu studieren, studieren die neuronale und vaskuläre Plastizität des Fettgewebes unter verschiedenen physiologischen Bedingungen. Immunolabeling-fähigen dreidimensionale Bildgebung Lösungsmittel geclearte Organe (iDISCO +) Gewebe Clearing ist ein Prozess, bestehend aus Methanol Vorbehandlung, Immunolabeling, und das clearing von Gewebe Undurchsichtigkeit mit organischen chemischen Reagenzien Dichlormethan (DCM ) und Dibenzyl Äther (DBE)13,14. Durch das Fettgewebe völlig transparent zu machen, erhalten Sie eine genauere Darstellung der Anatomie des Gewebes wie Blutgefäße und neuronalen Fasern9,10. IDISCO + hat Vorteile, es kompatibel mit verschiedenen Antikörpern und fluoreszierende Reporter11,14 ist, und sie Erfolg in mehreren Organen und sogar Embryoes14 hat. Die wichtigste Einschränkung ist jedoch eine lange Inkubationszeit, in der 18 bis 20 Tagen erforderlich sind, um das gesamte Experiment zu vervollständigen.
Eine weitere wichtige Anwendung der gesamten-Mount Färbung ist die Visualisierung der Zelle Schicksal in Kombination mit einer Linie-Tracing-System. Linie die Ablaufverfolgung ist die Kennzeichnung eines bestimmten Gens/Markers in eine Zelle, die an alle Tochterzellen weitergegeben werden kann und über Zeit15konserviert ist. Als solches ist es ein leistungsfähiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um das Schicksal einer Zelle Nachkommen15. Seit den 1990er Jahren das Cre-LoxP rekombinante System geworden ein leistungsfähiger Ansatz für die Linie Ablaufverfolgung in lebenden Organismen15. Wenn eine Mauslinie, die Cre, ein DNA-Enzym Rekombinase, drückt mit einer anderen Maus mit dem Ausdruck eines Reporters, der neben einer LoxP-STOP-LoxP-Sequenz ist überschritten wird, ist das Reporter-Protein ausgedrückt15.
Für das gesamte-Mount zu beflecken, eignet sich die Verwendung von fluoreszierenden multicolor Reporter für imaging von Fettgewebe, denn es minimale Störungen mit intrazellulären Aktivitäten des Adipocyte16 ermöglicht. Traditionelle Reporter Fleck jedoch in der Regel Zytoplasma, macht es schwierig, die Abstammung des weißen Adipozyten, verfolgen die zytoplasmatischen Inhalt17beschränkt haben. Um dieses Problem zu überwinden, ist die Verwendung von fluoreszierenden TdTomato/Membran Membrane-springen eGFP (mT/mG) Reporter Marker ein ideales Werkzeug. Membran-bezogenen TdTomato drückt sich in Cre-negativen Zellen18. Auf Cre Exzision tritt eine Umstellung auf die Expression von Membran-gezielte eGFP, eignet sich dieser Reporter für die Verfolgung der Linie Adipocyte Stammväter17,18 (Ergänzende Abbildung 1).
Dieses Papier soll vorsehen, dass ein detailliertes Protokoll vollständig-hängen Färbung und zeigen, wie es mit anderen Techniken zur Untersuchung der Entwicklung und Physiologie des Fettgewebes kombiniert werden kann. Zwei Beispiele für Anwendungen, die in diesem Protokoll beschrieben sind seine Verwendung mit 1) multicolor Reporter Mauslinien unterschiedlicher Herkunft von Adipozyten und (2) Gewebe löschen um weitere visualisieren die neuronale Arborization im weißen Fettgewebe (WAT) zu identifizieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Obwohl herkömmliche Techniken wie Histologie und Cryosection Vorteile für die Beobachtung von intrazellulären Struktur bieten, bietet ganz-Mount Färbung eine andere Perspektive in Fettgewebe Forschung, die 3D Visualisierung der zellulären ermöglicht Architektur der gering verarbeitete Gewebe.
Um erfolgreich durchzuführen, ganz-Mount zu beflecken, sollten folgende Hinweise berücksichtigt werden. Verschiedenen Fettgewebe-Depots können verschiedene Immunostaining Ergebnissen führen; Dah…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde finanziert durch Zuschüsse aus den Naturwissenschaften und Engineering Research Council (NSERC) von Kanada, Pilot und Feasibility Study Grant Banting & Best Diabetes Zentrum (BBDC), der SickKids-Gründerfonds, H-K. S., Medical Research Center Program (2015R1A5A2009124) durch die National Research Foundation von Korea (NRF) gefördert durch das Ministerium für Wissenschaft, IKT und Zukunft planen, J-r.k.
Materials
| LipidTox | Life Technologies | H34477 | |
| PECAM-1 primary antibody | Millipore | MAB1398Z(CH) | |
| TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody | Millipore | AB152, AB1542 | |
| DAPI stain | BD Pharmingen | 564907 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| Ultramicroscope I | LaVision BioTec | Light sheet image fluorescent microscope | |
| Alexa Fluor secondary antibodies | Jackson ImmunoResearch | Wavelengths 488, 594 and 647 used | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BioSciences | 553141 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dibenzyl-ether | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A452-1 | |
| 30% Hydrogen Peroxide | BIO BASIC CANADA INC | HC4060 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | J7126 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Lectin kit I, fluorescein labeled | VECTOR LABORATORIES | FLK-2100 | |
| F4/80 | Bio-Rad | MCA497GA | |
| VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI | VECTOR LABORATORIES | H-1500 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | |||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | |||
| Triton-X | |||
| Tween | |||
| Animal serum (goat, donkey) |
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