המוקד של המחקר הנוכחי הוא להמחיש את כולה-הר immunostaining והדמיה הטכניקה כשיטת אידיאלי עבור הדמיה תלת-ממדית של רכיב סלולרי ואדריכלות רקמת שומן.
רקמת שומן הוא איבר חשוב מטבולית עם פלסטיות גבוה, והוא מגיב לגירויים סביבתיים, מזין מעמד. ככזה, טכניקות שונות פותחו כדי ללמוד על מורפולוגיה וביולוגיה של רקמת שומן. עם זאת, שיטות הדמיה קונבנציונאלי מוגבלות ללמוד את הרקמה בסעיפים 2D, נכשל ללכוד את הארכיטקטורה תלת-ממד של האיבר כולו. כאן אנו מציגים כולה-הר מכתים, שיטה אימונוהיסטוכימיה ששומרת מורפולוגיה רקמת שומן ללא פגע עם שלבי עיבוד מינימלי. לפיכך, המבנים של adipocytes ורכיבים אחרים התאית נשמרים ללא עיוות, השגת את קנאס לוויזואליזציה תלת-ממדית של הרקמה. בנוסף, כולה-הר מכתים יכול להיות משולב עם שושלת היוחסין שיטות מעקב כדי לקבוע החלטות גורל התא. עם זאת, טכניקה זו יש כמה מגבלות לספק מידע מדויק לגבי בחלק העמוק של רקמת שומן. כדי להתגבר על מגבלה זו, כולה-הר מכתים יכול להיות משולב עם עוד רקמות ניקוי טכניקות כדי להסיר את opaqueness של רקמת ולאפשר הדמיה מלאה של אנטומיה כולה רקמת שומן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אור גיליונות. לכן, רזולוציה גבוהה יותר וייצוג מדויקת יותר של רקמת שומן מבנים ניתן ללכוד עם השילוב של טכניקות אלה.
רקמת שומן הוא איבר חיוני עבור אחסון אנרגיה, מאופיין על-ידי נערכו דינמי והרחבת כמעט ללא הגבלה1. בנוסף אנרגיה הומאוסטזיס, רקמת שומן גם ממלא תפקיד חיוני הפרשת הורמון adipokines מעל 50 לווסת פונקציה מטבולית לכל הגוף2. רקמת שומן יש של ארכיטקטורה מגוונת הכוללת של סוגי תאים שונים לרבות adipocytes בוגר, fibroblasts, תאי אנדותל, תאים חיסוניים adipocyte קדמון תאים3. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי השמנת יתר, תפקוד מטבולי אחר יכול לשנות משמעותית את תפקוד רקמת שומן ואת microenvironment שלו, אשר כולל אך אינו מוגבל להגדלה של adipocytes, חדירה של תאים דלקתיים (למשל, macrophages), ותפקוד כלי הדם3.
טכניקות מורפולוגי שגרתיות כגון היסטולוגיה ו- cryosectioning להדגים מספר מגבלות ללמוד ביולוגיה אדיפוז כגון שלבי עיבוד כימי ממושך, אשר יכול להוביל רקמות הצטמקות ומבנה עיוות3, 4. יתר על כן, טכניקות 2D אלה אינם מספיקים לקיים אינטראקציות המערכת שהופעל על ידי סוגי תאים שונים, כמו הסעיפים שהושגו מוגבלת לאזורים קטנים יותר של רקמת כולה3. בהשוואה לקונבנציונלי שיטות הדמיה פלורסנט, כולה-הר מכתים אינה דורשת שלבים פולשניים נוספים, כגון הטבעה, חלוקתה, התייבשות; לכן, זה מונע את הבעיה של צמצום נוגדן ירידה לפרטים. ככזו, היא שיטה פשוטה ויעילה עבור הדמיה רקמת שומן, עם שימור טוב יותר של רקמת שומן הכולל מבנה5ומורפולוגיה adipocyte. לכן, כל הר מכתים כל טכניקה מהירה וזולה immunolabeling הוקם כדי לשמר את רקמת שומן ארכיטקטורה תלת-ממד1,6,7,8.
עם זאת, למרות שימור רקמת שומן מורפולוגיה עם השימוש כולה-הר מכתים, טכניקה זו היא עדיין מסוגלים לדמיין את המבנים הפנימיים מתחת לפני השטח השומנים של הרקמה. מספר האחרונות מחקרים9,10 הקימו רקמות ניקוי טכניקות בשילוב עם1,כולה-הר immunolabeling6 כדי לאפשר לוויזואליזציה תלת-ממדית מקיפה בתוך רקמת שומן. בפרט, רשתות עצביות, להערכת צפופה היו דמיינו האחרונות מחקרים9,10,11,12 עם הדמיה תלת-ממדי. אכן, לומד את פלסטיות עצבית ואת כלי הדם של רקמת שומן בתנאים פיזיולוגיים שונים חיוני ללמוד ביולוגיה שלה. מאופשר Immunolabeling הדמיה תלת-ממדית של ניקוי רקמות איברים הממס-והפנים (iDISCO +) הוא תהליך מורכב של מתנול קדם טיפול, immunolabeling, וניקוי של רקמת opaqueness עם ריאקטיבים כימיים אורגניים דיכלורומתאן (DCM ) ו dibenzyl (אנגלית) אתר13,14. על ידי ביצוע של רקמת שומן שקוף לחלוטין, ייצוג מדויק יותר של האנטומיה בתוך רקמת הדם ו סיבים עצביים ניתן להשיג9,10. IDISCO + יש יתרונות בכך שהוא תואם נוגדנים שונים,11,כתבים פלורסנט14, זה הוכיח הצלחה איברים מרובים, אפילו embryoes14. עם זאת, מגבלה הראשי שלה הוא זמן דגירה ארוך, שבו 18-20 ימים יש צורך להשלים את הניסוי כולו.
יישום חשוב נוסף של צביעת כולה-הר הוא הפריט החזותי של גורל בשילוב עם מערכת מעקב אחר שושלת היוחסין. מעקב אחר שושלת היוחסין היא תוויות של הגן/סמן ספציפי בתא ניתן להעביר כל התאים הבת, כולו מעל הזמן15. ככזה, הוא כלי רב עוצמה שיכול לשמש כדי לקבוע את גורלו של רומא התא15. מאז שנות ה-90, המערכת רקומביננטי Cre-LoxP הפכה בגישה רב-עוצמה עבור מעקב אחר שושלת היוחסין חי אורגניזמים15. כאשר קו העכבר המבטאת Cre, אנזים recombinase ה-DNA, הוא חצה עם קו אחר העכבר לבטא כתב הסמוכה לרצף loxP-עצור-loxP, החלבון הכתב הוא ביטוי15.
עבור כל-הר מכתים, השימוש של כתבים ססגוניות פלורסנט מתאים הדמיה של רקמת שומן, כי זה מאפשר התערבות מינימלית עם פעילויות תאיים של adipocyte ה-16. עם זאת, כתבים מסורתיים בדרך כלל כתם הציטופלסמה, ולכן קשה לאתר את שושלת היוחסין של לבן adipocytes, אשר מוגבלת תוכן cytoplasmic17. כדי להתגבר על בעיה זו, השימוש של קרום מכורך פלורסנט tdTomato/ממברנה eGFP (mT/מ ג) כתב סמן הוא כלי אידיאלי. TdTomato, ממוקדות ממברנה מתבטא Cre-שלילי תאים18. על כריתה Cre, לעבור הביטוי של eGFP, ממוקדות ממברנה מתרחש, שהופך את הכתב מתאים לאתר את שושלת היוחסין של adipocyte אבות17,18 (איור משלים 1).
מטרת מאמר זה היא לספק פרוטוקול מפורט עבור כל-הר מכתים ולהראות איך זה יכול להיות משולב עם טכניקות אחרות ללמוד פיתוח, הפיזיולוגיה של רקמת שומן. שתי דוגמאות של יישומים שמתואר פרוטוקול זה הם השימוש עם הכתב 1) ססגוניות קווים העכבר כדי לזהות את המקורות השונים של adipocytes ו- 2) רקמת ניקוי להמחיש עוד יותר את arborization עצבית של שומן לבן (וואט).
למרות טכניקות שגרתיות כגון היסטולוגיה ו- cryosection להציע יתרונות להתבוננות מבנה תאיים, כולה-הר מכתים מספק נקודת מבט שונה במחקר רקמת שומן, המאפשרת הדמיה תלת-ממדית של הסלולרי ארכיטקטורה של רקמות מינימלית מעובד.
על מנת לבצע בהצלחה את כולה-הר מכתים, ההצעות הבאות צריכה להילקח בחשבו?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומן על ידי מענקים מדעי הטבע, המועצה מחקר הנדסי (NSERC) של קנדה, טייס, מענק מחקר היתכנות של בנטינג & הטוב סוכרת במרכז (BBDC), לקרן סטארט-אפ SickKids H-ק’ ס’, רפואי מרכז תכנית המחקר (2015R1A5A2009124) דרך לאומי מחקר קרן של קוריאה (ב- NRF) ממומן על ידי משרד המדע, תקשוב, העתיד מתכנן J-ר. ק
LipidTox | Life Technologies | H34477 | |
PECAM-1 primary antibody | Millipore | MAB1398Z(CH) | |
TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody | Millipore | AB152, AB1542 | |
DAPI stain | BD Pharmingen | 564907 | |
Nikon A1R confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
Ultramicroscope I | LaVision BioTec | Light sheet image fluorescent microscope | |
Alexa Fluor secondary antibodies | Jackson ImmunoResearch | Wavelengths 488, 594 and 647 used | |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BioSciences | 553141 | |
Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
Dibenzyl-ether | Sigma-Aldrich | 33630 | |
Methanol | Fisher Chemical | A452-1 | |
30% Hydrogen Peroxide | BIO BASIC CANADA INC | HC4060 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | J7126 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
Lectin kit I, fluorescein labeled | VECTOR LABORATORIES | FLK-2100 | |
F4/80 | Bio-Rad | MCA497GA | |
VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI | VECTOR LABORATORIES | H-1500 | |
Paraformaldehyde (PFA) | |||
Phosphate Buffer Saline (PBS) | |||
Triton-X | |||
Tween | |||
Animal serum (goat, donkey) |