Fokus for studien er å vise hele-mount immunostai- og visualisering teknikken som en ideell metode for 3D-bildebehandling av fettvev arkitektur og cellular komponenten.
Fettvev er et viktig metabolsk organ med høy plastisitet og svarer til miljømessige stimuli og næringsstoffer status. Som sådan, er ulike teknikker utviklet for å studere morfologi og biologi av fettvev. Men er konvensjonelle visualisering metoder begrenset til å studere vevet i 2D deler, unnlater å fange 3D arkitektur hele orgel. Her presenterer vi hele-mount flekker, en immunohistochemistry metode som beholder intakt fettvev morfologi med minimal behandlingstrinnene. Dermed opprettholdes konstruksjoner av adipocytter og andre cellulære komponenter uten forvrengning, oppnå mest representative 3D-visualisering av vev. I tillegg kan hele-mount flekker kombineres med avstamning sporing metoder for å bestemme cellen skjebne beslutninger. Denne teknikken har imidlertid noen begrensninger til å gi nøyaktig informasjon om dypere deler av fettvev. For å overkomme denne begrensningen, kan hele-mount flekker videre kombineres med vev clearing teknikker for å fjerne opaqueness av vev og tillater fullstendig oversikt over hele fettvev anatomi bruker lys arks fluorescerende mikroskopi. Derfor kan en høyere oppløsning og mer nøyaktig gjengivelse av fettvev strukturer hentes med kombinasjonen av disse teknikkene.
Fettvev er et viktig organ for energilagring og er preget av dynamisk ombygging og nesten ubegrenset utvidelse1. I tillegg til energi homeostase spiller fettvev også en viktig rolle i hormon sekresjonen over 50 endotelial å modulere hele kroppen metabolsk funksjon2. Fettvev har en variert arkitektur består av forskjellige celletyper inkludert eldre adipocytter, fibroblaster, endotelceller, immunceller og adipocyte stamfar celler3. Nyere studier har vist at fedme og andre metabolsk dysfunksjon kan betydelig endre fettvev funksjon og dens microenvironment, som inkluderer men er ikke begrenset til utvidelse av adipocytter, infiltrasjon av inflammatoriske celler (f.eks makrofager), og vaskulær dysfunksjon3.
Konvensjonelle morfologiske teknikker som histology og og kryosnitt vise flere begrensninger i å studere adipose biologi som lange kjemisk behandling skritt, som kan føre til vev krymping og struktur forvrengning3, 4. Videre er disse 2D teknikkene ikke nok å observere intercellulære interaksjoner utøves av ulike celletyper, som delene innhentet er begrenset til mindre regioner av hele vev3. Forhold til konvensjonelle metoder for fluorescerende bildebehandling, hele-mount flekker ikke krever flere invasiv trinn, som innebygging, skjæring og dehydrering; Dermed unngår dette problemet minskende antistoff spesifisitet. Som sådan, er det en enkel og effektiv metode for bildebehandling fettvev, med bedre bevaring av adipocyte morfologi og generelle fettvev struktur5. Derfor hele-mount flekker som en rask og rimelig immunolabeling teknikk var etablert fettvev 3D arkitektur1,6,7,8.
Men til tross for bevaring av fettvev morfologi med bruk av hele-mount flekker er denne teknikken fremdeles ikke kan visualisere indre strukturer under lipid overflaten av vev. Flere nyere studier9,10 har etablert vev clearing teknikker kombinert med hele-mount immunolabeling1,6 å gi omfattende 3D-visualisering i fettvev. Spesielt var tett nevrale og blodkar nettverk visualisert i nyere studier9,10,11,12 med 3D-volum imaging. Faktisk er studere nevrale og vaskulær plastisitet av fettvev under ulike fysiologiske forhold viktig å studere sin biologi. Immunolabeling-aktivert tredimensjonale imaging av løsemiddel klarert organer (iDISCO +) vev clearing er en prosess består av metanol forbehandling, immunolabeling, og clearing av vev opaqueness med organisk kjemiske reagenser diklormetan (DCM ) og dibenzyl Eter (DBE)13,14. Ved å gjøre fettvev helt gjennomsiktig, kan en mer nøyaktig gjengivelse av anatomi i vevet som blodkar og nevrale fibre fås9,10. IDISCO + har fordeler i at det er kompatibelt med forskjellige antistoffer og fluorescerende journalister11,14, og det har demonstrert suksess i flere organer og selv embryoes14. Men er den viktigste begrensningen en lang incubation periode, der 18 til 20 dager kreves for å fullføre hele eksperimentet.
Et annet viktig program for hele-mount flekker er visualisering av cellen skjebne i kombinasjon med en slektslinje sporing system. Avstamning sporing er merking av et bestemt gen/indikator i en celle som kan sendes videre til alle datter celler og er bevart over tid15. Som sådan, er det et kraftig verktøy som kan brukes til å avgjøre skjebnen til en celle avkom15. Siden 1990 grobunn-LoxP rekombinant systemet har blitt en kraftig metode for avstamning sporing i levende organismer15. Når en mus linje som uttrykker grobunn, en DNA recombinase enzym, er krysset med en annen mus linje uttrykke reporter som er til en loxP-STOP-loxP sekvens, er reporter protein uttrykt15.
For hele-mount flekker, er bruk av fluorescerende multicolor journalister egnet for imaging av fettvev fordi det gir minimale forstyrrelser med intracellulære aktiviteter adipocyte16. Men flekken tradisjonelle journalister vanligvis cytoplasma, gjør det vanskelig å spore slektslinje hvit adipocytter, som har begrenset cytoplasmatiske innhold17. Du løser dette problemet, er bruken av membran-bundet fluorescerende tdTomato/membran eGFP (mT/mG) reporter markør et ideelt verktøy. Membran målrettede tdTomato uttrykkes i grobunn-negativ celler18. På grobunn excision oppstår bytte til uttrykk for membran målrettede eGFP, gjør denne reporteren egnet for sporing slektslinje adipocyte progenitors17,18 (Supplerende figur 1).
Formålet med denne utredningen er å gi en detaljert protokoll for hele-mount flekker og viser hvordan den kan kombineres med andre teknikker å studere utviklingen og fysiologi av fettvev. To eksempler på programmer som er beskrevet i denne protokollen er bruken med 1) multicolor reporter musen linjer å identifisere ulike opprinnelsen til adipocytter og 2) vev fjerne for å ytterligere visualisere den nevrale arborization i hvit fettvev (WAT).
Selv om konvensjonelle teknikker som histology og cryosection fordeler for å observere intracellulær struktur, gir hele-mount flekker et annerledes perspektiv i fettvev forskning, som muliggjør 3D-visualisering av mobilnettet arkitekturen av minimalt prosesserte vev.
For å utføre hele-mount flekker, bør følgende forslag tas i betraktning. Forskjellige fettvev depoter kan gi ulike immunostai-resultater; dermed bør av fettvev depot brukes fastsettes først. For eksempel, er brun fettvev …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av tilskudd fra naturvitenskap og Engineering Research Council (NSERC) Canada, Pilot og mulighetsstudie studier Grant av Banting & beste Diabetes sentrum (BBDC), SickKids oppstart fondet til H-K. S., Medical Research Center Program (2015R1A5A2009124) gjennom de National Research Foundation av Korea (NRF) finansiert av departementet for vitenskap, IKT og fremtid planlegger å J-RK
LipidTox | Life Technologies | H34477 | |
PECAM-1 primary antibody | Millipore | MAB1398Z(CH) | |
TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody | Millipore | AB152, AB1542 | |
DAPI stain | BD Pharmingen | 564907 | |
Nikon A1R confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
Ultramicroscope I | LaVision BioTec | Light sheet image fluorescent microscope | |
Alexa Fluor secondary antibodies | Jackson ImmunoResearch | Wavelengths 488, 594 and 647 used | |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BioSciences | 553141 | |
Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
Dibenzyl-ether | Sigma-Aldrich | 33630 | |
Methanol | Fisher Chemical | A452-1 | |
30% Hydrogen Peroxide | BIO BASIC CANADA INC | HC4060 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | J7126 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
Lectin kit I, fluorescein labeled | VECTOR LABORATORIES | FLK-2100 | |
F4/80 | Bio-Rad | MCA497GA | |
VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI | VECTOR LABORATORIES | H-1500 | |
Paraformaldehyde (PFA) | |||
Phosphate Buffer Saline (PBS) | |||
Triton-X | |||
Tween | |||
Animal serum (goat, donkey) |