荧光标记小鼠神经元的单细胞 RNA 序列的人工分选和双体外转录与绝对计数测序 (天后-Seq)
Summary
本协议描述了将单个荧光标记神经元与体外转录的 mRNA 扩增分离以进行高深度单细胞 RNA 测序的人工分拣程序。
Abstract
单细胞 rna 测序 (rna 序列) 现在是一个广泛实施的工具, 用于测定基因表达。商业上可用的单细胞 RNA 测序平台不加区别地处理所有输入单元。有时, 在上游使用荧光活化细胞分类 (流化) 来隔离特定标记的感兴趣种群。流化的局限性是需要大量的输入细胞具有显著标记的分数, 这是不切实际的收集和分析稀有或稀疏标记的神经元种群从小鼠大脑。在这里, 我们描述了一种手动收集稀疏荧光标记单个神经元从新鲜分离的小鼠脑组织的方法。此过程允许捕获具有高纯度的单标记神经元, 并随后与体外转录放大协议相结合, 以保留内源转录比。我们描述了一种双线性放大方法, 它使用唯一的分子标识符 (医药学) 来生成单个 mRNA 计数。两轮的扩增会导致每个单细胞的基因检测高度。
Introduction
单细胞 rna 测序 (rna 序列) 改变了转录组研究。虽然可以使用各种技术 (如水滴1、2、微流体3、nanogrids4和 microwells5) 执行大型单细胞 RNAseq, 但大多数方法无法对定义的像元类型进行排序表达基因编码的荧光基团为了隔离选择的细胞种群, 荧光活化细胞分类 (流式) 通常用于在单细胞模式下对标记的细胞进行排序。然而, 流流仪有一些限制, 需要细致的样品处理步骤。首先, 通常需要大量的输入单元格 (通常每毫升有数个百万细胞), 其中包含标记种群的显著分数 (> 15–20%)。其次, 细胞制剂可能需要多轮的密度梯度离心步骤, 以除去可能堵塞喷嘴或流动细胞的胶质碎片、碎屑和细胞团簇。第三, 流式细胞仪通常采用染色和脱色步骤进行活/死染色 (例如4′-、6-diamidino-2-苯基吲哚 (DAPI)、丙啶碘化物 (PI) 和 Cytotracker 染料), 这会占用更多时间。第四, 作为双色排序的经验法则 (如 DAPI 和绿/红荧光蛋白 (GFP/RFP)), 通常需要两个样本和一个控制, 要求除了所需的鼠标应变之外, 还需要处理未标记的样本。第五, 过滤通常在样品排序之前和期间多次执行, 以主动防止流式机中的采样线堵塞。第六, 必须在最常用的流式处理装置中分配时间, 以初始化和稳定流体流动并执行液滴校准。第七, 控制样本通常在实际样本采集之前按顺序运行, 以设置补偿矩阵、双峰抑制、设置门等.用户可以提前执行步骤六和七, 或者要求技术人员并行协助。最后, 后流后, 经常有步骤, 以确保只有标记的单个单元格中存在每个井;例如, 通过在高内容筛选设置 (如快速平板成像仪) 中检查样本。
为了规避上述步骤, 并促进相对快速、有针对性的单荧光标记神经元的小种群序列, 我们描述了一个手动分拣程序, 后跟两轮高度敏感的体外扩增协议, 称为双体外转录与绝对计数排序 (天后-Seq)。RNA 扩增和 cDNA 文库的生成是从 Eberwine等。6和 Hashimshony等。7、有一定的修改, 适合小鼠中间神经元的蜂窝体积较小;此外, 我们还发现, 它对兴奋性锥体神经元同样有用。
Protocol
Representative Results
Discussion
手动排序协议适用于神经元种群的受监督 RNA 序列, 它们要么是稀疏标记在小鼠大脑中, 要么代表一个罕见的细胞种群, 否则使用当前高通量细胞进行研究是不可行的。排序和放大方法。根据喷嘴尺寸和所需的事件速率, 在 9–14 psi 范围内, 受流管的细胞通常会承受鞘和采样线压力。此外, 当从喷嘴中弹出时, 细胞可以在收集管表面坚硬, 或涂有样品缓冲液的油井, 造成冲击应力。在手动分拣过程中, 这…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了 NIH (5R01MH094705-04 和 R01MH109665-01 至 Z.J.H.)、CSHL 罗伯逊神经科学基金 (Z.J.H.) 和 NARSAD 博士后奖学金 (美联社) 的资助。
Materials
| ERCC RNA Spike-In Control Mixes | Thermo Fisher | Cat# 4456740 | |
| SuperScript III | Thermo Fisher | Cat# 18080093 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | Cat# 10777019 | |
| RNA fragmentation buffer | New England Biolabs | Cat# E6105S | |
| RNA MinElute kit | Qiagen | Cat# 74204 | |
| Antarctic phosphatase | New England Biolabs | Cat# M0289 | |
| Poly nucleotide kinase | New England Biolabs | Cat# M0201 | |
| T4 RNA ligase2, truncated | New England Biolabs | Cat# M0242 | |
| Ampure Xp magnetic beads | Beckman Coulter | Cat# A63880 | |
| SPRIselect size selection magnetic beads | Thermo Fisher | Cat# B23317 | |
| DL-AP5 | Tocris | Cat# 0105 | |
| CNQX | Tocris | Cat# 1045 | |
| TTX | Tocris | Cat# 1078 | |
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | Cat# P5147 | |
| Message Amp II kit | Thermo Fisher | Cat# AM1751 | |
| Carbogen | Airgas | Cat# UN3156 | |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | Cat# 761036 | |
| Illumina TrueSeq smallRNA kit | Illumina | Cat# RS-200-0012 | |
| Bioanalyzer RNA Pico chip | Agilent | Cat# 5067-1513 | |
| Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip | Agilent | Cat# 5067-4626 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | ||
| Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics. (Leica model MZ-16F). | Leica | Model MZ-16F | |
| Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm. | Warner instruments | Model GC100-15, Order# 30-0017 | |
| Capillary pipette puller | Sutter Instruments Co | P-97 | |
| Vibratome | Thermo Microm | HM 650V | |
| Vibratome tissue cooling unit | Thermo Microm | CU 65 |
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