Sequenziamento di RNA unicellulare di neuroni di topo fluorescente contrassegnati con cernita manuale e doppia trascrizione In Vitro con conteggi assoluti sequenziamento (DIVA-Seq)
Summary
Questo protocollo descrive il manuale procedura per isolare singoli neuroni fluorescente contrassegnati seguiti in vitro basati su trascrizione di mRNA amplificazione per la sequenza di RNA di alta profondità unicellulare di ordinamento.
Abstract
Sequenziamento di singola cellula RNA (RNA-seq) è ormai uno strumento ampiamente implementato per diluire l’espressione genica. Piattaforme di RNA-sequenziamento unicellulare commercialmente disponibili elaborano tutti gli input cellule indiscriminatamente. A volte, fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) sono usata a Monte per isolare una popolazione specificamente con etichetta di interesse. Una limitazione di FACS è la necessità di un numero elevato di celle di input con frazioni significativamente con etichetta, che è pratico per la raccolta e profilatura popolazioni rare o scarsamente etichettati neurone dal cervello del topo. Qui, descriviamo un metodo per raccogliere manualmente sparse fluorescente etichettati singoli neuroni da appena dissociato del tessuto di cervello di topo. Questo processo consente per l’acquisizione di neuroni con etichetta singola con elevata purezza e successiva integrazione con protocollo in vitro basati su trascrizione amplificazione che mantiene rapporti di trascrizione endogena. Descriviamo un metodo di amplificazione lineare doppia che utilizza identificatori univoci molecola (UNMIS) per generare singoli mRNA conteggi. Due turni di risultati di amplificazione in un elevato grado di rilevazione del gene al singola cella.
Introduction
Sequenziamento di singola cellula RNA (RNA-seq) ha trasformato la trascrittomica studi. Mentre su larga scala singola cellula RNAseq può essere eseguita utilizzando una varietà di tecniche, come le goccioline1,2, microfluidica3, nanogrids4e micropozzetti5, maggior parte dei metodi non possono ordinare tipi di cella definita che esprimono codificato geneticamente fluorofori. Per isolare una popolazione di selezionare la cella, fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) sono spesso usata con etichettate celle in una cella singola modalità di ordinamento. Tuttavia, FACS presenta alcune restrizioni e richiede fasi di lavorazione meticolosa del campione. In primo luogo, un gran numero di celle di input è in genere necessari (spesso parecchie milioni cellule / mL), con una frazione significativa (> 15 – 20%) contenente la popolazione con etichetta. In secondo luogo, preparazioni di cellule possono richiedere vari cicli di passaggi di centrifugazione su gradiente di densità rimuovere frazione glial, detriti e mucchi di cella che potrebbero altrimenti intasare l’ugello o flusso delle cellule. In terzo luogo, FACS impiega solitamente di colorazione e decolorazione passaggi per live/dead colorazione (ad esempio, 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), ioduro di propidio (PI) e coloranti Cytotracker), che prendere ulteriore tempo. In quarto luogo, come una regola empirica per ordinamento (ad esempio DAPI e proteina fluorescente verde/rosso (GFP/RFP)), di solito due campioni di due colori e un controllo sono necessari, che richiedono un campione senza etichetta per essere elaborati oltre il ceppo del mouse desiderato. In quinto luogo, filtro viene spesso eseguito più volte prima e durante l’ordinamento di campione per prevenire in maniera proattiva le righe di esempio intasato in una macchina di FACS. Sesto, il tempo deve essere assegnato in configurazioni di FACS più comunemente utilizzati per inizializzare e stabilizzare il flusso fluido e realizzare la calibratura della gocciolina. Settimo, controllo campioni vengono in genere eseguiti in sequenza prima della raccolta del campione reale per impostare la pagina di matrici di compensazione, rifiuto del doppietto, impostazione gates, utenti ecc o procedere sei e sette stessi prima del tempo o richiedono la assistenza di un tecnico in parallelo. Infine, post-FACS, spesso ci sono misure per garantire che solo etichettati singole cellule sono presenti in ciascun pozzetto; ad esempio, controllando i campioni in un setup di screening ad alto contenuto ad esempio un imager piatto veloce.
Per aggirare la procedura descritta sopra e facilitare un relativamente rapido, mirato sequenziamento di una piccola popolazione di singoli neuroni fluorescente contrassegnati, descriviamo un manuale di procedura seguita da due turni di un altamente sensibile in vitro di ordinamento protocollo di amplificazione, chiamato doppio in vitro trascrizione con conteggi assoluti sequenziamento (DIVA-Seq). La generazione della libreria di amplificazione e cDNA di RNA è adattata da Eberwine et al. 6 e Hashimshony et al. 7, con alcune modifiche per soddisfare interneuroni del mouse che hanno più piccoli volumi cellulare; ancora, abbiamo anche trovato che è altrettanto utile per eccitanti neuroni piramidali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il manuale di protocollo di ordinamento è adatto per un supervisione sequenziamento di RNA del neurone popolazioni che sono sia scarsamente etichettati nel cervello di topi o rappresentano una popolazione di cellule rari che altrimenti non è fattibile per studiare mediante cella di alto-rendimento corrente metodi di ordinamento e di amplificazione. Cellule sottoposte a FACS solitamente subiscono pressioni di linea guaina e campione nella gamma di psi ~ 9 – 14, a seconda delle dimensioni dell’ugello e desiderato tassi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal NIH (5R01MH094705-04 e R01MH109665-01 al Z.J.H.), dal fondo di neuroscienze CSHL Robertson (a Z.J.H.) e da un NARSAD induttrici nell’Unione fraterna (A.P.).
Materials
| ERCC RNA Spike-In Control Mixes | Thermo Fisher | Cat# 4456740 | |
| SuperScript III | Thermo Fisher | Cat# 18080093 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | Cat# 10777019 | |
| RNA fragmentation buffer | New England Biolabs | Cat# E6105S | |
| RNA MinElute kit | Qiagen | Cat# 74204 | |
| Antarctic phosphatase | New England Biolabs | Cat# M0289 | |
| Poly nucleotide kinase | New England Biolabs | Cat# M0201 | |
| T4 RNA ligase2, truncated | New England Biolabs | Cat# M0242 | |
| Ampure Xp magnetic beads | Beckman Coulter | Cat# A63880 | |
| SPRIselect size selection magnetic beads | Thermo Fisher | Cat# B23317 | |
| DL-AP5 | Tocris | Cat# 0105 | |
| CNQX | Tocris | Cat# 1045 | |
| TTX | Tocris | Cat# 1078 | |
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | Cat# P5147 | |
| Message Amp II kit | Thermo Fisher | Cat# AM1751 | |
| Carbogen | Airgas | Cat# UN3156 | |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | Cat# 761036 | |
| Illumina TrueSeq smallRNA kit | Illumina | Cat# RS-200-0012 | |
| Bioanalyzer RNA Pico chip | Agilent | Cat# 5067-1513 | |
| Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip | Agilent | Cat# 5067-4626 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | ||
| Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics. (Leica model MZ-16F). | Leica | Model MZ-16F | |
| Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm. | Warner instruments | Model GC100-15, Order# 30-0017 | |
| Capillary pipette puller | Sutter Instruments Co | P-97 | |
| Vibratome | Thermo Microm | HM 650V | |
| Vibratome tissue cooling unit | Thermo Microm | CU 65 |
References
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