Encellede RNA sekvensering av Fluorescently merket musen Neurons med manuell sortering og dobbel In Vitro transkripsjon absolutte teller sekvensering (DIVA-Seq)
Summary
Denne protokollen beskriver manuell sortering fremgangsmåten for å isolere enkelt fluorescently merket neurons etterfulgt av i vitro transkripsjon-baserte mRNA forsterkning for høy-dybde encellede RNA sekvensering.
Abstract
Encellede RNA sekvensering (RNA-seq) er nå et vidt gjennomført verktøy for assaying genuttrykk. Kommersielt tilgjengelige encellede RNA-sekvensering plattformer behandle alle innsettingsceller ukritisk. Fluorescens-aktivert cellen sortering (FACS) brukes noen ganger oppstrøms isolere en spesielt merket befolkning av interesse. En begrensning av FACS er behovet for høyt antall innsettingsceller med betydelig merket fraksjoner, som er upraktisk for innsamling og profilering sjeldne eller tynt merket Nevron bestander fra musen hjernen. Her beskriver vi en metode for manuelt å samle spredte fluorescently merket enkelt neurons fra ferske dissosiert musen hjernevev. Denne prosessen tillater fanger single-merket neurons med høy renhetsgrad og påfølgende integrering med en i vitro transkripsjon-baserte forsterkning protokoll som bevarer endogene transkripsjon prosenter. Vi beskriver en dobbel lineær forsterkning metode som bruker unike molekyl identifikatorer (UMIs) til å generere individuelle mRNA teller. To runder av forsterkning gir en høy grad av genet per enkelt celle.
Introduction
Encellede RNA sekvensering (RNA-seq) har forvandlet transcriptomic studier. Mens store encellede RNAseq kan utføres ved hjelp av en rekke teknikker, som dråper1,2, microfluidics3, nanogrids4og microwells5, kan ikke de fleste metoder sortere definerte celletyper som uttrykker genetisk kodet fluorophores. For å isolere et merke celle befolkningen, brukes fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) ofte til å sortere merkede celler i én celle modus. Men FACS har noen begrensninger og krever nitid eksempel behandlingstrinnene. Først, et stort antall innsettingsceller er vanligvis nødvendig (ofte flere millioner celler per mL), med en betydelig andel (> 15-20%) som inneholder merket befolkningen. Andre kan cellen preparater kreve flere runder med tetthet gradert sentrifugering fremgangsmåte for å fjerne glial brøkdel, avfall og celle klumper som kan ellers tette munnstykket eller flow cellen. Tredje bruker FACS vanligvis flekker og destaining trinn for live/døde flekker (f.eks 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), propidium iodide (PI) og Cytotracker fargestoffer), som tar opp ekstra tid. Fjerde, som en tommelfingerregel for to farger sortering (som DAPI og grønn/rød fluorescerende protein (GFP/RFP)), vanligvis to eksempler og en kontroll er nødvendig, krever en umerket prøve behandles i tillegg til ønsket musen belastningen. Femte utføres filtrering ofte flere ganger før og under eksempel sortering for å proaktivt forhindre tette utvalg linjer i en FACS maskin. Sjette må tid være tildelt i vanligste FACS oppsett å initialisere og stabilisere væske strømmen og utføre slippverktøy kalibrering. Syvende, kontroll prøver vanligvis kjøres i rekkefølge før samlingen faktisk prøve å konfigurere kompensasjon matriser, doublet avvisning, gates, etc. brukere enten utføre trinn seks og sju selv forhånd eller krever det hjelp av en tekniker parallelt. Til slutt, innlegget-FACS, det er ofte skritt for å sikre at bare merket én celler, finnes i hver brønn; for eksempel ved å sjekke prøver i et høyt innhold screening oppsett som en rask plate imager.
Å omgå innstillinger og tilrettelegge en relativt rask, målrettet sekvensering av en liten populasjon av enkelt fluorescently merket neurons, beskriver vi en manuell sortering prosedyren etterfulgt av to runder med en svært følsom i vitro forsterkning protokollen, kalt dobbel in vitro transkripsjon med absolutte teller sekvensering (DIVA-Seq). Den RNA forsterkning og cDNA bibliotek generasjonen er tilpasset fra Eberwine et al. 6 og Hashimshony et al. 7, med enkelte modifikasjoner for mus interneurons som har mindre mobilnettet volum; Videre har vi også funnet at det er like nyttige for eksitatoriske pyramidale nevroner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Manuell sortering protokollen er egnet for en veiledet RNA sekvensering av Nevron populasjoner som enten tynt merket i mus hjernen eller representerer en sjelden celle populasjon som ellers ikke er mulig å studere med gjeldende høy gjennomstrømming cellen sortering og forsterkning metoder. Celler underlegges FACS vanligvis gjennomgå skjede og prøve linje press i størrelsesorden ~ 9-14 psi, avhengig av størrelsen på munnstykket og ønsket hendelse priser. Dessuten, ved å være kastet ut av munnstykket, kan cellen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra NIH (5R01MH094705-04 og R01MH109665-01 til Z.J.H.) av CSHL Robertson nevrovitenskap Fund (til Z.J.H.) og av et NARSAD Post-Doctoral fellesskap (til A.P.).
Materials
| ERCC RNA Spike-In Control Mixes | Thermo Fisher | Cat# 4456740 | |
| SuperScript III | Thermo Fisher | Cat# 18080093 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | Cat# 10777019 | |
| RNA fragmentation buffer | New England Biolabs | Cat# E6105S | |
| RNA MinElute kit | Qiagen | Cat# 74204 | |
| Antarctic phosphatase | New England Biolabs | Cat# M0289 | |
| Poly nucleotide kinase | New England Biolabs | Cat# M0201 | |
| T4 RNA ligase2, truncated | New England Biolabs | Cat# M0242 | |
| Ampure Xp magnetic beads | Beckman Coulter | Cat# A63880 | |
| SPRIselect size selection magnetic beads | Thermo Fisher | Cat# B23317 | |
| DL-AP5 | Tocris | Cat# 0105 | |
| CNQX | Tocris | Cat# 1045 | |
| TTX | Tocris | Cat# 1078 | |
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | Cat# P5147 | |
| Message Amp II kit | Thermo Fisher | Cat# AM1751 | |
| Carbogen | Airgas | Cat# UN3156 | |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | Cat# 761036 | |
| Illumina TrueSeq smallRNA kit | Illumina | Cat# RS-200-0012 | |
| Bioanalyzer RNA Pico chip | Agilent | Cat# 5067-1513 | |
| Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip | Agilent | Cat# 5067-4626 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | ||
| Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics. (Leica model MZ-16F). | Leica | Model MZ-16F | |
| Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm. | Warner instruments | Model GC100-15, Order# 30-0017 | |
| Capillary pipette puller | Sutter Instruments Co | P-97 | |
| Vibratome | Thermo Microm | HM 650V | |
| Vibratome tissue cooling unit | Thermo Microm | CU 65 |
References
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Xin, Y., et al. Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).
- Gao, R., et al. Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer. Nature Communications. 8 (1), 228 (2017).
- Yuan, J., Sims, P. A. An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq. Scientific Reports. 6, 33883 (2016).
- Eberwine, J., et al. Analysis of gene expression in single live neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).
- Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification. Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).
- Paul, A., et al. Transcriptional Architecture of Synaptic Communication Delineates GABAergic Neuron Identity. Cell. 171 (3), 522-539 (2017).
- Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 1934, (2015).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).
- Okaty, B. W., et al. Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System. Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).
- Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).
- Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability. Genome Biology. 17, 101 (2016).
- Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).
