크립토코커스-아메바 상호 작용 을 연구할 때 현미경 기술과 형광 읽기의 상호 보완적 사용
Summary
이 논문에서는 스틸, 형광 이미지 및 고해상도 투과 전자 현미경 이미지를 사용하여 연구되는 크립토코카인 세포 및 아메바의 공동 배양을 준비하기 위한 프로토콜을 자세히 설명합니다. 여기에 예시된 것은 정량적 데이터가 이러한 정성적 정보를 보완하는 방법입니다.
Abstract
Cryptococcus 감염을 시뮬레이션하기 위해 환경에서 크립토 코카인 세포의 자연 포식자인 아메바를 대식세포의 모델로 사용할 수 있습니다. 대식세포와 유사한 이 육식 유기체는 식세포증을 사용하여 내면화된 세포를 죽입니다. 공초점 레이저 스캐닝 현미경의 도움으로 크립토 코카인 세포와 아메바 사이의 대화형 순간을 묘사하는 이미지가 캡처됩니다. 전자 현미경의 분해력은 또한 아메바 식품 액포내부에 갇혀있을 때 크립토 코카인 세포의 초구조적 세부 사항을 밝히는 데 도움이됩니다. 식세포증은 지속적인 과정이기 때문에 정량적 데이터가 분석에 통합되어 이미지가 캡처될 때 시점에서 어떤 일이 발생하는지 설명합니다. 구체적으로, 상대 형광 단위는 크립토 코카인 세포를 내화에 아메바의 효율을 정량화하기 위해 판독된다. 이를 위해 크립토코카인 세포는 염료로 염색되어 식품 액포의 산성 환경 내에 한 번 형광이 가해집니다. 함께 사용 하는 경우, 이러한 기술을 통해 수집 된 정보는 아메바에 의해 내면화 될 때 세포의 행동과 운명에 결론을 도출 하는 데 도움이 중요 한 정보를 제공할 수 있습니다., 아마도, 다른 식세포 세포에 의해.
Introduction
미생물은 토양과 물의 열린 물리적 경계와 같은 다른 생태 틈새 에서 점유하고 번창하기 위해 시간이 지남에 따라 진화, 다른 사람의 사이에서1. 이러한 틈새 시장에서, 미생물은 종종 제한된 자원에 대한 직접 경쟁에 종사; 중요한 것은, 그들은 증가 인구를 수용 할 필요가 자신의 성장이나 공간을 지원하기위해 사용하는 영양소에 대한 2,3. 어떤 경우에, 아메바와 같은 일부 홀로주체 유기체는 심지어 그들의 바이오 매스에서 영양분을 추출하는방법으로 크립토 코카인 세포에 선행 할 수있다 4,5. 차례로, 이것은 그 먹이의 인구 수를 제어하여 영토 지배를 확립 할 수 있습니다. 이러한 약탈적 압력 때문에, 일부 먹이는 압력의 부정적인 영향을 조정하기 위해크립토코칼 캡슐 6과 같은 미생물 인자를 생성하도록 선택될 수 있다. 그러나, 이 압력의 의도하지 않은 결과로, 몇몇 세균은 종 장벽을 교차하고 영양분이 풍부하고이상적인 인체의 밀폐된 공간 같이 7를 식민지화하는 새로운 틈새 시장을 찾아내는 것을 허용하는 요인을 얻습니다 조건. 후자는 크립토 코커스 (C.) 같은지상파 미생물을 설명 할 수있다. 네오포만은 병원성으로 변할 수 있습니다.
이를 위해, 크립토 코카인 세포가 아메바와 가질 수있는 초기 접촉을 연구하는 것이 중요하고이 병원성이 될 그들을 선택할 수있는 방법. 더 구체적으로, 이것은 감염 도중 대식세포에 의해 행동할 때 cryptococcal 세포가 어떻게 행동하는지에 단서를 줄 수 있습니다. 이러한 이유로 아메바는 상대적으로 저렴하고 실험실에서 아메바의 문화를 유지하기 쉽기 때문에 여기에 대식세포의 모델로 선택되었습니다8. 관심의 또한 크립토 코카인 이차 대사 산물 을 조사하는 것이었습니다. 3-하이드록시 지방산9,10 아메바 및 크립토 코카인 세포 사이의 상호 작용에 영향을 미치는.
아메바와 육안으로의 먹이 사이의 상호 작용을 인식하는 간단한 방법은 한천 접시의 표면에 먹이를 사용하여 잔디를 만들고 아메바를 발견하는 것입니다. 한천 판에 플라크 또는 클리어 영역의 시각화는 아메바가 먹이를 먹였을 수 있는 영역을 묘사합니다. 그러나이 매크로 수준에서는 프로세스의 결과만 지적되며 식세포증의 과정은 기계화 될 수 없습니다. 따라서, 세포 대 세포 에 기초하여 과정을 이해하기 위해,11,12를사용할 수 있는 몇 가지 현미경 방법이 있다. 예를 들어, 인큐베이션 챔버를 가진 거꾸로 된 현미경은 식세포와 그 표적13사이의 사건의 시간 경과를 비디오로 기록하는데 사용될 수 있다. 불행히도, 시간 경과 기능을 가진 현미경의 비용으로 인해 실험실이 특히 자원 불량 설정에서 이러한 현미경을 구입하는 것이 항상 가능한 것은 아닙니다.
위의 한계를 피하기 위해, 이 연구는 C. 네오포르만스 비즈 C. 네오포르만스 UOFS Y-1378 및 C. 네오포르만스 LMPE 046아칸타모에바 카스텔라니의 상호작용을 평가하는 순차적 탐구 설계를 제시한다. . 첫째, 정량적 방법 앞에 정성적 방법이 사용됩니다. 정지 심상은 반전된 형광 현미경, 뿐만 아니라 아메바-Cryptococcus 상호 작용을 묘사하는 전송 전자 현미경을 사용하여 캡처됩니다. 이어서 플레이트 리더를 사용하여 형광을 정량화하여 아메바의 효율을 추정하여 크립토코카인 세포를 내화시켰다. 데이터 해석 단계에서 이러한 방법의 결과를 조정할 때 식세포증 시간 경과 비디오를 정독하는 것만큼 중요한 정보를 똑같이 드러낼 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
논문에서, 아메바가 크립토 코카인 세포와 상호 작용할 때 발생할 수있는 가능한 결과를 밝히기 위해 다른 기술이 성공적으로 사용되었습니다. 또한, 우리는 Cryptococcus-amoeba 상호 작용의 결과에 3-하이드록시 지방산의 효과를 보여주기 위해 관심이 있었습니다.
사용된 첫번째 기술은 정지 심상을 렌더링하는 공초점 현미경 검사법이었습니다. 이 기술의 주요 단점은 특?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 남아프리카 공화국의 국립 연구 재단 (보조금 번호 : UID 87903)과 자유 국가의 대학에서 보조금에 의해 지원되었다. 우리는 또한 우리의 현미경 연구 기간 동안 피터 반 와이크와 핸리 그로블러가 제공하는 서비스와 지원에 감사드립니다.
Materials
| 1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane | Sigma-Aldrich | D27802 | – |
| 1.5-mL plastic tube | Thermo Fisher Scientific | 69715 | – |
| 15-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 7252018 | – |
| 50-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 1132017 | – |
| 8-Well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 1109650 | – |
| Acetone | Merck | SAAR1022040LC | – |
| Amoeba strain | ATCCÒ | 30234TM | – |
| ATCC medium 712 | ATCCÒ | 712TM | Amoeba medium |
| Black 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 152089 | – |
| Centrifuge | Hermle | – | – |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | – |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TE 2000 | – |
| Epoxy resin: | |||
| [1] NSA | [1] ALS | [1] R1054 | – |
| [2] DER 736 | [2] ALS | [2] R1073 | – |
| [3] ERL Y221 resin | [3] ALS | [3] R1047R | – |
| [4] S1 (2-dimethylaminoethanol) | [4] ALS | [4] R1067 | – |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F4274 | – |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 489441 | – |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Fisher Scientific | 374-91038C | Microplate reader |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | – |
| Glutaraldehyde | ALS | R1009 | – |
| Hemocytometer | Boeco | – | – |
| Lead citrate | ALS | R1209 | – |
| Liquid Chromatography Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | – | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | R 34,860 | – |
| Orbital shaker | Lasec | – | – |
| Osmium tetroxide | ALS | R1015 | – |
| pHrodo Green Zymosan A BioParticles | Life Technologies | P35365 | This is the pH-sensitive dye |
| Physiological buffer solution | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | – |
| Rotary shaker | Labcon | – | – |
| Sodium phosphate buffer: | |||
| [1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate | [1] Merck | [1] 106580 | – |
| [2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate | [2] Merck | [2] 106345 | |
| Transmission electron microscope | Philips | Philips EM 100 | – |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | – |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | – |
| Uranyl acetate | ALS | R1260A | – |
| Vacuum dessicator | Lasec | – | – |
| Vial | Sigma-Aldrich | 29651-U | – |
| YNB | Lasec | 239210 | – |
| YPD agar | Sigma-Aldrich | Y-1500 | – |
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