Här visar vi metoderna för in-vivo kvantifiering av leukocyt avstigning från naiva, inflammerad, och maligna murina hud. Vi utför en head-to-head jämförelse av två modeller: transdermal FITC ansökan och i situ photoconversion. Vi visar dessutom nyttan av photoconversion för att spåra leukocyt avstigning från kutana tumörer.
Leukocyt avstigning från perifera vävnader till dränerande lymfkörtlar är inte bara avgörande för immun övervakning och initiering utan bidrar även till resolution av perifer vävnad svaren. Medan en mängd metoder används för att kvantifiera leukocyt avstigning från icke-lymfoida, perifera vävnader, förblir de cellulära och molekylära mekanismer som reglerar innehållsberoende avstigning dåligt förstådd. Här, beskriver vi användningen av i situ photoconversion för kvantitativ analys av leukocyt avstigning från murina hud och tumörer. Photoconversion möjliggör direkt märkning av leukocyter bosatta inom kutan tissue. Om huden utsätts för ultraviolett ljus inducerar lokala kännetecknas inflammatoriska svar av leukocyt infiltrat och vaskulära leakiness, i en head-to-head jämförelse med transdermal applikation av fluorescerande spårämnen, photoconversion specifikt märkt flyttande dendritiska cellpopulationer och samtidigt aktiverade kvantifiering av myeloiska och lymfoida avstigning från kutana mikromiljö och tumörer. Mekanismer för egress leukocyt förbli en komponent som saknas i vår förståelse av intratumoral leukocyt komplexitet och således tillämpningen av verktygen som beskrivs häri ger unik insikt i dynamiken i tumör immun mikromiljö båda vid steady state och som svar på behandling.
Perifer vävnad immunsvar formas inte bara av leukocyt rekrytering till platser av inflammation, men också av mekanismer som reglerar deras efterföljande kvarhållandet. Skyddande immunitet styrs således av kumulativa cellulära och molekylära mekanismer som avgör huruvida en leukocyt träder, vistelser inom, eller snarare migrerar ut ur perifer vävnad via lymfkärl. Ännu viktigare, är benägenheten för leukocyter att avsluta vävnad genom lymfkärl (kallas avstigning) kopplad till sina specialiserade funktioner. Dendritiska celler (DC) förvärva flyttande beteende som svar till mognad signaler leder till antigen transport och presentation i dränerande lymfkörtlar (dLN), en process som är nödvändig för adaptiv immunitet1. Rensning myeloida celler, såsom makrofager och neutrofiler, tjäna till att rensa apoptotiska skräp genom fagocytos. Under bakterieinfektion, neutrofiler avstigning vävnad och slutligen genomgå apoptos i dLNs2 och en modell av DSS-inducerad kolit, data stödjer hypotesen att makrofag avstigning är nödvändigt att lösa lokal inflammation3. Om antal neutrofiler och makrofager avstigning uppstår i alla inflammatoriska sammanhang är dock okänd. Bevis för T-lymfocyter avstigning från steady state4,5,6,7, infekterade8och inflammerade4,9,10, 11,12 perifer, icke-lymfoida vävnader indikerar att återcirkulera aktivt T-celler, men de tissue-baserade signaler som kör denna avfart förblir dåligt förstådd. Flera studier har identifierat signaler behövs för riktad övergång till dränering lymfatiska kapillärer och efterföljande avstigning inklusive chemokine (C-C motiv) ligand 21 (CCL21) och dess receptor CCR74,11, 13, chemokine (C-X-C motiv) ligand 12 (CXCL12) och dess receptor CXCR42,14, och sfingosin-1-fosfat-(S1P)10,15,16. Dessa mekanismer är inte aktiva i alla sammanhang dock och huruvida de fastställa avstigning av alla celltyper förblir en öppen fråga. Ännu viktigare, ytterligare kräver insikt om de mekanismer som reglerar avstigning och dess funktionella relevans i sjukdom kvantitativa i vivo analysmetoder.
Flera metoder har använts för att kvantifiera avstigning i flera djurmodeller i vivo inklusive direkta kanylering av lymfkärl, överföring av ex vivo märkta leukocyter, transdermal applikation av fluorescerande spårämnen, injektion av märkta partiklar och i vivo photoconversion17,18. Direkta kanylering av afferenta mus lymfkärl är svårt och begränsad i små djur av volymerna av vätska som kan samlas in. Kanylering har således till stor del utförts i stora djur (t.ex., får) där sådana kirurgiska manipulationer är praktiska. Dessa studier ger direkta bevis för förekomsten av både lymfoida och myeloida celler i lymfan10,19,20. Dessutom avslöjar får modeller att akut och kronisk inflammation ökade nästan 100 gånger10,21lymfocyter närvaro i lymfan.
Överföring av märkta och genetiskt manipulerade lymfocyter har allt avslöjat att CCR7 krävs för avstigning av CD4+ T celler från akut inflammerad hud5,11, medan förbehandling av lymfocyter med små molekylen S1P-receptoragonist hämmar FTY720, endast delvis sina avstigning10. Intressant, avstigning av överförda lymfocyter från kroniskt inflammerad hud är CCR7-oberoende10, men kräva delvis CXCR49. Överföring experiment, dock leverera icke-fysiologiskt antal ex vivo aktiveras och märkta lymfocyter in vävnaden genom injektion, vilket förändrar den biomekaniska miljön av vävnader och förhöjda interstitiell vätska tryck som öppna inledande lymfatiska kapillärer och förändra deras transport boenden22. Som ett alternativ, transdermal applicering av fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC) i närvaro eller frånvaro av dermal irriterande (t.ex., dibutylftalat, DBP) eller infektion23,24 möjliggör spårning av Fagocytos celler som ackumuleras tracer och migrera till dLNs. Likaså ger fluorescently märkt tumörer ett sätt att spåra Fagocytos celler som har uppslukat tumör material25. Dessa metoder har gett viktig insikt om de mekanismer som styr DC utgång13,14,17,26,27 men inte kan spåra icke-fagocytos lymfocyter och tolkning kan kompliceras av gratis lymfdränage av lösliga FITC således märkning stannfågel, LN bosatt DCs.
Alternativt, intravital mikroskopi är ett kraftfullt verktyg som möjliggör in-vivo spårning av fysiologiskt relevanta leukocyt populationer i realtid28,29. Används i kombination med reporter möss och antikroppsbaserade i vivo märkning Immunofluorescerande, intravital mikroskopi har avslöjat komplexet rumsliga och tidsmässiga dynamiken i immun cell människohandel, inklusive interstitiell migration30 , själavandring över de lymfatiska endotelet, passage inom lymfatiska lumen och migration på LN post28,31. Brett antagandet av intravital avbildningstekniker begränsas av bekostnad, nödvändig expertis för uppsättning upp, och begränsade genomströmning för att kvantifiera flera celltyper. Fortfarande, koppling kvantitativa metoder att analyserar populationsdynamik vävnader med intravital imaging kommer att ge ytterligare och viktiga mekanistisk insikt beträffande mekanismer motilitet och migration mot och inom lymfatiska kapillärer 18 , 31 , 32.
Följaktligen i vivo photoconversion har vuxit fram som en metod som möjliggör i situ märkning, oberoende av fagocytiska aktiviteten, och för kvantifiering av fysiologiska leukocyt avstigning (när den kombineras med flödescytometri) i den avsaknaden eller förekomsten av utmaning. Kaede-Tg möss express konstitutivt ett protein som isolerats från stenig korallrev som uppvisar grön fluorescens (Kaede grön) tills utsätts för ultraviolett ljus, varefter det irreversibelt konverterar till röd fluorescens (Kaede röd)33. Photoconverted celler kan spåras som de avstigning från perifer vävnad webbplatser och ackumuleras i dLNs. Detta och andra liknande photoconvertible mus modeller34,35 har avslöjat viktig biologi inklusive konstituerande avstigning av regulatoriska T-celler från huden36, CXCR4-beroende B cell avstigning från Peyers37 , mobilisering av resident T minnesceller vid peptid rechallenge38och bred leukocyt avstigning från tumör mikromiljö39. Häri, utför vi en head-to-head jämförelse av photoconversion med transdermal FITC ansökan i samband med kutan inflammation och infektion som möjliggör direkt jämförelse av befintliga data med metoden photoconvertible. Dessutom vi demonstrera photoconversion i implanterade tumörer och beskriva verkningsgraden och selektiv avstigning från tumör mikromiljö. Som sådan, hävdar vi att ytterligare tillämpning av dessa metoder krävs att belysa leukocyt avstigning från tumörer, som kommer att ha betydande konsekvenser för att tolka intratumoral leukocyt komplexitet, anti-tumor immunitet, kritiska biologi och behandlingssvaret.
Även om den leukocyt avstigning från perifera, icke-lymfoida vävnader är kritiska för initiering och upplösning av immunreaktioner, är de molekylära mekanismer som reglerar avstigning dåligt känd. Denna lucka i kunskap beror till stor del på tillgången av verktyg för kvantifiering i vivo. Här, beskriver vi användningen av photoconvertible möss (Kaede-Tg) för att kvantifiera endogena leukocyt avstigning från huden och tumörer och ge en direkt head-to-head jämförelse med FITC färg i inflammat…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Dr Marcus Bosenberg för att tillhandahålla YUMM 1.1 och YUMM 1,7 murina melanom linjer och Dr Deborah J. Fowell för att tillhandahålla B6. CG-Tg(CAG-tdKaede) 15Utr möss i samförstånd med RIKEN BRC genom nationella Bio-resursen i MEXT, Japan.
Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
DNase | Roche | 4536282001 | |
Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtor | Prizmatix Ltd | V8144 | |
Fluorescein isothiocyanate isomer I | Sigma-Aldrich | F4274 | |
dibutyl phthalate | Sigma-Aldrich | 524980 | |
acetone | Macron Fine Chemicals | 2440-02 | |
29-guage syringes | Exel International | 26029 | |
Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | |
70 um cell strainers | VWR | 732-2758 | |
paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
HBSS | Caisson | HBL06 | |
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L34966 | |
Purified Anti-mouse CD16/CD32 | Tonbo Biosciences | 70-0161-M001 | |
BV605 CD11c (clone N418) | Biolegend | 117334 | |
PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2) | BD Pharmingen | 562363 | |
BV421 CD3e (clone 145-2C11) | Biolegend | 100341 | |
APC CD8a (clone 53-6.7) | TonBo Biosciences | 20-0081-u100 | |
APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
BV650 CD19 (clone 6D5) | Biolegend | 115541 | |
PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4) | Biolegend | 128011 | |
Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8) | Biolegend | 123121 | |
APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8) | Biolegend | 127623 | |
BV711 CD11b (clone M1/70) | Biolegend | 101241 | |
BV605 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103155 | |
BV711 CD4 (clone RM4-5) | BD Biosciences | 563726 | |
Bovine serum albumin (Fraction V) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle Set | BD Biosciences | 552845 | |
Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
FlowJo v10 Software | FlowJo |