Quantifizierung der Leukozyten Egress über Lymphgefäße aus murinen Haut und Tumoren
Summary
Hier zeigen wir die Methoden zur in Vivo Quantifizierung der Leukozyten Ausstieg aus naiv, entzündet, und bösartigen murinen Haut. Wir führen einen direkten Vergleich der beiden Modelle: transdermale FITC Anwendung und in Situ Ladungszustand. Darüber hinaus zeigen wir den Nutzen der Ladungszustand für die Verfolgung von Leukozyten Egress von kutanen Tumoren.
Abstract
Leukozyten-Ausstieg aus den peripheren Geweben, Lymphknoten ist nicht nur wichtig für die Immunüberwachung und Einleitung, sondern trägt auch zur Lösung der peripheren Gewebe Antworten. Während eine Vielzahl von Methoden werden verwendet, um die Leukozyten Ausstieg aus den nicht-lymphatischen, peripheren Geweben zu quantifizieren, bleiben die zellulären und molekularen Mechanismen, die Kontext-abhängige ausgehenden Regeln schlecht verstanden. Hier beschreiben wir die Verwendung von in Situ Ladungszustand für Quantitative Analyse der Leukozyten Ausstieg aus murinen Haut und Tumoren. Ladungszustand ermöglicht die direkte Kennzeichnung von Leukozyten in Hautgewebe aufhalten. Obwohl die Exposition der Haut gegenüber UV-Licht induziert lokale Entzündungsreaktionen Leukozyten Infiltrate und geprägt vaskulären Undichtigkeit in einem Direktvergleich mit transdermalen Anwendung von fluoreszierenden Tracern Ladungszustand speziell wandernde dendritische Zellenbevölkerungen beschriftet und aktiviert gleichzeitig die Quantifizierung der myeloischen und lymphatischen Egress von kutanen Mikroumgebungen und Tumoren. Die Mechanismen der Leukozyten Egress bleiben eine fehlende Komponente in unserem Verständnis der intratumorale Leukozyten Komplexität und damit die Anwendung der hier beschriebenen Tools bieten einzigartige Einblicke in die Dynamik der Tumor immun Mikroumgebungen beide im Steady State und im Ansprechen auf die Therapie.
Introduction
Periphere Gewebe Immunantworten sind geprägt durch Leukozyten Einstellung zu den Standorten von Entzündungen, sondern auch durch Mechanismen, die ihre spätere Aufbewahrung zu Regeln. Somit richtet sich schützende Immunität durch kumulative zellulären und molekularen Mechanismen, die bestimmen, ob ein Leukozyten eingibt, Aufenthalte innerhalb, oder besser gesagt aus peripheren Gewebe über Lymphgefäße migriert. Wichtig ist, ist die Neigung für Leukozyten Gewebe durch Lymphgefäße (genannt Egress) beenden ihre speziellen Funktionen verbunden. Dendritische Zellen (DC) erwerben Wanderungsverhalten in Reaktion auf Reifung Signale führt zu Antigen-Transport und Präsentation in Entleerung Lymphknoten (dLN), ein Prozess, der für adaptive Immunität1erforderlich ist. Aufräumvorgang myeloische Zellen wie Makrophagen und Neutrophilen, dienen der Apoptotic Rückstand durch Phagozytose zu löschen. Während der bakteriellen Infektion Neutrophilen Brandschutzzeichen Gewebe und letztlich Apoptose in dLNs2 und in einem Modell der DSS-induzierte Kolitis, Daten unterstützen die Hypothese, dass Makrophagen Egress lokale Entzündung3lösen muss. Ob Neutrophilen und Makrophagen Egress Auftritt in allen entzündlichen zusammenhängen, ist allerdings unbekannt. Beweise für die T-Lymphozyten Egress von Steady-State4,5,6,7, infizierte8und entzündeten4,9,10, 11,12 periphere, nicht-lymphatischen Gewebe zeigt, dass T-Zellen aktiv umwälzen, obwohl die gewebebasierten Signale, die diese Ausfahrt fahren schlecht verständlich bleiben. Mehrere Studien identifizierten Signale für gerichtete Migration in Richtung Entwässerung lymphatische Kapillaren und die anschließende Brandschutzzeichen einschließlich Chemokin (C-C-Motiv) Liganden 21 (CCL21) und seines Rezeptors CCR74,11, 13, Chemokin (C-X-C Motiv) Liganden 12 (CXCL12) und sein Rezeptor CXCR42,14, sowie Sphingosine-1-Phosphat (S1P)10,15,16. Diese Mechanismen sind nicht in allen Kontexten tätig, und ob sie Ausgang alle Zelltypen bestimmen, bleibt eine offene Frage. Wichtig ist, bedarf weiterer Einblick in die Mechanismen, die für Ausstieg und seine funktionelle Relevanz bei der Krankheit gelten quantitative in-Vivo -Methoden der Analyse.
Verschiedene Methoden wurden verwendet, um Ausstieg in mehreren Tiermodellen in Vivo einschließlich direkter Kanülierung der Lymphgefäße, Adoptiv Transfer von ex-Vivo mit der Bezeichnung Leukozyten, transdermale Anwendung von fluoreszierenden Tracer zu quantifizieren, Einspritzung der beschriftete Partikel und in Vivo Ladungszustand17,18. Direkte Kanülierung der afferenten Maus Lymphgefäße ist schwierig und Kleintiere begrenzt durch die Menge an Flüssigkeit, die gesammelt werden können. So Kanülierung vor allem bei großen Tieren durchgeführt wurde (zB., Schafe) wo solche chirurgischen Manipulationen sind praktisch. Diese Studien liefern direkte Hinweise auf das Vorhandensein des lymphatischen und myeloischen Zellen in Lymphknoten10,19,20. Darüber hinaus zeigen Schafe Modelle, dass akute und chronische Entzündungen Lymphozyten Präsenz in Lymphe durch fast 100-fold10,21 erhöht.
Adoptiveltern Übertragung von beschrifteten und genetisch manipulierter Lymphozyten hat vor allem ergeben, dass CCR7 für den Ausstieg von CD4 benötigt+ T-Zellen von akut entzündeten Haut5,11, während der Vorbehandlung von Lymphozyten mit dem kleinen Molekül S1P-Rezeptor-Agonist hemmt FTY720, nur teilweise ihren Ausgang10. Interessanterweise der Egress von übertragenen Lymphozyten von chronisch entzündete Haut ist CCR7-unabhängige10, aber erfordern teilweise CXCR49. Adoptiv-Transfer Experimente, liefern jedoch physiologisch Zahlen von Ex-Vivo aktivierte und beschriftete Lymphozyten in das Gewebe durch Injektion, die biomechanische Umwelt von Geweben und erhöhten interstitiellen Fluiddrücke verändert das erste lymphatische Kapillaren öffnen und ändern ihre Transport-Eigenschaften-22. Als alternative, transdermale Anwendung von Fluorescein erfolgt (FITC) in das Vorhandensein oder Fehlen von dermalen Reizstoffe (zB., Dibutyl Phthalat, DBP) oder Infektion23,24 ermöglicht die Verfolgung von phagocytic Zellen, die Tracer zu sammeln und zu dLNs migrieren. In ähnlicher Weise können Eindringmittel beschriftete Tumoren phagocytic Zellen zu verfolgen, die Tumor Material25verschlungen haben. Diese Methoden haben wichtige Einblicke in die Mechanismen zur Verfügung gestellt, die regieren DC Ausgang13,14,17,26,27 , aber sind nicht in der Lage, nicht-phagocytic verfolgen Lymphozyten und Interpretation können durch kostenlose Lymphdrainage des löslichen FITC so Kennzeichnung nicht migrierend LN ansässige DCs erschwert werden.
Alternativ ist intravitalen Mikroskopie ein leistungsfähiges Werkzeug, das in Vivo Verfolgung von physiologisch relevanten Leukozyten Populationen in Echtzeit28,29ermöglicht. In Kombination mit dem Reporter Mäuse und Antikörper-basierten in Vivo immunofluorescent Kennzeichnung intravitalen Mikroskopie ergab die komplexe räumliche und zeitliche Dynamik der immunen Zellen des Drogenhandels, einschließlich interstitielle Migration30 , Seelenwanderung über das lymphatische Endothel, Passage innerhalb der lymphatischen Lumen und Migration auf LN Eintrag28,31. Breite Akzeptanz der intravitalen bildgebenden Verfahren wird durch Kosten, notwendige Know-how zum Einrichten, begrenzt und beschränkt Durchsatz zur Quantifizierung der mehrere Zelltypen. Dennoch werden Kupplung quantitative Methoden, die Populationsdynamik analysieren Gewebe mit intravitalen Bildgebung zusätzliche und wichtige mechanistischen in Bezug auf die Mechanismen der Motilität und Migration in Richtung und im lymphatischen Kapillaren Einblick 18 , 31 , 32.
Infolgedessen in Vivo Ladungszustand entstanden als eine Methode, die in Situ zu etikettieren, erlaubt unabhängig von phagocytic Tätigkeit und für die Quantifizierung der physiologischen Leukozyten Ausgang (wenn in Verbindung mit Durchflusszytometrie) in der fehlen oder Vorhandensein von Herausforderung. Kaede-Tg Mäuse express konstitutiv ein Protein isoliert von Stony Coral, die grüne Fluoreszenz (Kaede grün) aufweist, bis UV-Licht ausgesetzt nach denen es irreversibel zu rote Fluoreszenz (Kaede rot)33umwandelt. Photoconverted Zellen können verfolgt werden, wie sie von Seiten der peripheren Gewebe Brandschutzzeichen und reichern sich in dLNs. Dies und andere ähnliche Photoconvertible Maus Modelle34,35 ergaben sich wichtige Biologie einschließlich konstitutive Egress von regulatorischen T-Zellen von Haut36, CXCR4-abhängige B Zelle Austritt von Peyer Patches37 , Mobilisierung von Residenten Speicher T-Zellen auf Peptid erneut herausfordern38und breiten Leukozyten Egress von Tumor Mikroumgebungen39. Hier führen wir einen direkten Vergleich der Ladungszustand mit transdermalen FITC Anwendung im Rahmen der kutanen Entzündung und Infektion mit der Photoconvertible-Methode zum direkten Vergleich der vorhandenen Daten zu ermöglichen. Wir zeigen Ladungszustand im implantierten Tumoren und beschreiben die Umwandlungs-Leistungsfähigkeit und selektive Egress von Tumor Mikroumgebungen. So, wir argumentieren, dass die weitere Anwendung dieser Methoden benötigt wird, um die kritische Biologie der Leukozyten Egress von Tumoren, aufzuklären, die erhebliche Auswirkungen auf die Interpretation intratumorale Leukozyten Komplexität, anti-Tumor Immunität haben wird und Ansprechen auf die Therapie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Obwohl der Leukozyten Egress von peripheren, nicht-lymphatischen Geweben für die Initiierung und Auflösung der Immunantwort ankommt, sind die molekularen Mechanismen, die ausgehenden Regeln kaum erforscht. Diese Wissenslücke ist vor allem auf hohe Verfügbarkeit von Werkzeugen für die Quantifizierung in Vivo. Hier beschreiben wir die Verwendung von Photoconvertible Mäusen (Kaede-Tg) zu quantifizieren endogenen Leukozyten Austritt aus der Haut und Tumoren eine direkte Direktvergleich mit FITC-Lack in entzün…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Dr. Marcus Bosenberg danken für die Bereitstellung YUMM 1.1 und 1.7 YUMM murinen Melanom Linien und Dr. Deborah J. Fowell für die Bereitstellung von B6. CG-Tg(CAG-tdKaede) 15Utr Mäuse im Einvernehmen mit RIKEN BRC durch nationale Bio-Ressource des MEXT, Japan.
Materials
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNase | Roche | 4536282001 | |
| Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtor | Prizmatix Ltd | V8144 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| dibutyl phthalate | Sigma-Aldrich | 524980 | |
| acetone | Macron Fine Chemicals | 2440-02 | |
| 29-guage syringes | Exel International | 26029 | |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | |
| 70 um cell strainers | VWR | 732-2758 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| HBSS | Caisson | HBL06 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L34966 | |
| Purified Anti-mouse CD16/CD32 | Tonbo Biosciences | 70-0161-M001 | |
| BV605 CD11c (clone N418) | Biolegend | 117334 | |
| PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2) | BD Pharmingen | 562363 | |
| BV421 CD3e (clone 145-2C11) | Biolegend | 100341 | |
| APC CD8a (clone 53-6.7) | TonBo Biosciences | 20-0081-u100 | |
| APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| BV650 CD19 (clone 6D5) | Biolegend | 115541 | |
| PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4) | Biolegend | 128011 | |
| Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8) | Biolegend | 123121 | |
| APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8) | Biolegend | 127623 | |
| BV711 CD11b (clone M1/70) | Biolegend | 101241 | |
| BV605 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103155 | |
| BV711 CD4 (clone RM4-5) | BD Biosciences | 563726 | |
| Bovine serum albumin (Fraction V) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle Set | BD Biosciences | 552845 | |
| Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10 Software | FlowJo |
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