マウスの皮膚腫瘍からリンパ管を介して白血球出口の定量化
Summary
ここでは、我々 は生体内の白血球、炎症、ナイーブから出口の定量化とマウス皮膚の悪性の方法を示します。我々 は 2 つのモデルの比較を実行: 経皮 FITC アプリケーションとその場で光電。さらに、光電性皮膚腫瘍から白血球出口を追跡するためのユーティリティを紹介します。
Abstract
末梢組織から排出リンパ節の白血球出口免疫監視の開始に重要ではありませんが、末梢組織の応答の解像度にも貢献しています。非リンパ系、末梢組織から白血球出口を定量化するためには、さまざまなメソッドを使用、文脈依存の出力を制御する細胞・分子メカニズムままかり。ここでは、マウスの皮膚腫瘍から白血球出口の定量分析のための in situ光電の使用について述べる。光電直接ラベル白血球の皮膚組織内で常駐が可能です。紫外光に肌の露出を引き起こすローカルも炎症反応によって特徴付けられる白血球浸潤と血管の水漏れしたため、蛍光トレーサーの経皮吸収型アプリケーションとの比較で光電具体的渡り鳥の樹状細胞集団をラベルし、皮膚微小と腫瘍から骨髄性とリンパの出口の定量化を同時に有効になっています。腫瘍内白血球複雑さの私達の理解の不足しているコンポーネントのまま白血球出口のメカニズムと免疫微小両方記載ツールのアプリケーションが腫瘍のダイナミクスにユニークな洞察を提供するため定常状態と治療への反応で。
Introduction
末梢組織の免疫反応は炎症のサイトに白血球動員だけでなく、後続の維持を調節するメカニズムによっても形成されます。したがって、防御免疫は、内で、滞在がリンパ管を介して末梢組織から移行というか白血球を入力すると、かどうかを決定する累積的な細胞および分子メカニズムによって決まります。重要なは、出口 (出口と呼ばれる) リンパ管を介して組織への白血球のための傾向は、その特殊な機能にリンクされます。樹状細胞 (DC) は、抗原輸送と排水のリンパ節 (dLN)、適応免疫1に必要なプロセスのプレゼンテーションにつながる成熟信号への応答での回遊行動を取得します。マクロファージや好中球などの清掃の骨髄細胞は貪食によりアポトーシス破片をオフになります。細菌感染時に好中球が組織を離脱、最終的に dLNs2で、DSS 誘発大腸炎モデルにおけるアポトーシスを受ける、データはマクロファージ出口局所炎症3を解決する必要がある仮説をサポートします。好中球とマクロファージの出口が炎症性のすべてのコンテキストで発生するかどうかも不明です。定常状態4,5,6、7、感染8、および炎症を起こして4,9,10、から T リンパ球の出口のための証拠11,12周辺機器、非リンパ系組織が、この出口を駆動する組織に基づく信号のままかり、T 細胞が積極的に循環させるを示します。いくつかの研究を特定 21 (CCL21) とその受容体 CCR74,11、ケモカイン (C C モチーフ) 配位子を含む出力の信号に向かってリンパ毛細血管を排出方向の移行に必要なその後 13ケモカイン (モチーフ C X) 12 (cxcl 12) リガンドとその受容体 CXCR42,14、そしてスフィンゴシン-1-リン酸 (S1P)10,,1516。しかし、これらのメカニズムはすべてのコンテキストでアクティブではない、未解決の問題が残っているかどうか、彼らはすべてのセル型の出力を決定します。重要なは、さらには、出口と疾患における関連性機能を制御するメカニズムに洞察力は体内の定量的分析の方法する必要があります。
複数モデル動物体内のリンパ管の直接カニューレ装着前のヴィヴォ標識白血球、蛍光トレーサーの経皮吸収型アプリケーションの養子の転送を含む出口を定量化するいくつかの方法が使用されています。ラベル付けされた粒子と生体内で光電17,18の注入。マウスの求心性リンパ管の直接穿刺が難しい、収集することができます流体のボリュームで小動物に限られました。大型の動物でカニュレーションが大きく行われてしたがって、(e.g。、羊) このような手術操作、実用的。これらの研究は、リンパ性と骨髄性リンパ10,19,20細胞の存在の直接的な証拠を提供します。さらに、羊のモデルは、急性および慢性の炎症がほぼ 100 の10、21でリンパでリンパ球の存在を増加することを明らかにします。
ラベルおよび遺伝子を組み換えられたリンパ球の養子の転送は CCR7 は CD4 の出口に必要な重要なは明らかに+ T 細胞急性炎症を起こした皮膚5,11, リンパ球の前処理中から小分子 S1P 受容体アゴニスト、FTY720、部分的にしか、出口10を抑制します。興味深いことに、慢性的な炎症を起こした皮膚から転送されたリンパ球の出口は CCR7 独立10が、部分的に CXCR49を必要があります。養子転送実験、ただし、提供ex vivoの非生理的番号活性およびラベル付けされたリンパ球挿入により、組織と間質性流体圧力の生体力学的環境を変える組織に初期リンパ毛細血管を開き、トランスポート プロパティ22を変更します。かに (FITC) 皮膚刺激の有無での代替、経皮吸収型アプリケーションとして (e.g、フタル酸ジブチル、DBP) または感染23,24の追跡が可能になります。トレーサーを蓄積し、dLNs に移行する貪食細胞。同様に、蛍光に分類された腫瘍は腫瘍材料25を飲み込んでいる貪食細胞を追跡する手段を提供します。これらのメソッドは、DC の出口13,14,17,26,の27を支配するが、非貪食を追跡することができるメカニズムの重要な洞察を提供しています。リンパ球と、解釈可溶性 FITC 非渡り鳥、こうしてラベリング LN バイオハザード Dc のリンパ排液無料によって複雑になることができます。
また、生体顕微鏡観察は、リアルタイム28,29生理関連の白血球ポピュレーションの生体内での追跡のためにできる強力なツールです。顕微鏡は空間の複合体を明らかにした生体レポーター マウスと体内に抗体を用いた免疫蛍光ラベリングと組み合わせて使用し、ダイナミクスの免疫細胞人身売買などの間質性の移行30、リンパ内皮、内リンパ腔と LN エントリ28,31に移行通路輪廻。生体イメージング技術の広範な採用経費、設定のための必要な専門知識によって制限され、種類の細胞を定量化のスループットを制限します。まだ、人口動態を分析定量メソッドを結合組織生体イメージング洞察を提供する追加と重要な機構運動とリンパ毛細血管内の移行のメカニズムに関して18,31,32。
その結果、生体内で光電として浮上しているメソッドをその場でラベルは、貪食活性の生理的白血球出口 (フローサイトメトリーによる結合) 時での定量化のために独立した、チャレンジの有無。楓 Tg マウスは恒常不可逆的赤い蛍光性 (楓赤)33に変換した後、紫の光にさらされるまで、蛍光グリーン (緑楓) を表わす石サンゴから分離した蛋白質を表現します。Photoconverted 細胞は末梢組織サイトから離脱する彼らを追跡できる、dLNs の蓄積します。これとその他似たような蛍光マウス モデル34,35肌36から制御性 T 細胞の構成の出口、パイエル板の37 から CXCR4 依存性 B 細胞の出口を含む重要な生物学を明らかにしました。、ペプチド再チャレンジ38、および広範な白血球腫瘍微小39から出口に常駐メモリー T 細胞の動員。ここで、皮膚の炎症や感染症蛍光法による既存データの直接比較を可能にするためのコンテキストで経皮 FITC アプリケーションと光電の比較を実行します。さらに、我々 は移植腫瘍における光電を示し、変換効率および腫瘍微小から選択的避難説明。など、私たちは腫瘍、腫瘍内白血球複雑さ、抗腫瘍免疫の解釈にとって重要な意義があるから白血球出口の重要な生物学の解明に更にこれらのメソッドのアプリケーションを必要と主張して療法への応答。
Protocol
Representative Results
Discussion
周辺機器、非リンパ系組織から白血球の出口は、開始と免疫応答の解像度の重要が、出口を支配する分子メカニズムはよくわかっていません。知識で、このギャップは主に定量化の vivoのためのツールの準備状況のためです。ここでは、蛍光マウス皮膚腫瘍から内因性白血球出口を定量化し、炎症性の FITC ペンキを直接頭に頭の比較を提供 (楓 Tg) と感染症モデルの使用について述べる?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、B6 を提供するため YUMM 1.1 YUMM 1.7 マウス黒色線と博士デボラ ・ j ・ Fowell を提供する博士マーカス ボーゼンベルクを感謝したいです。理研 BRC を通じて、国立生物資源文部科学省、日本の合意 cg Tg(CAG-tdKaede) 15Utr マウス。
Materials
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNase | Roche | 4536282001 | |
| Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtor | Prizmatix Ltd | V8144 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| dibutyl phthalate | Sigma-Aldrich | 524980 | |
| acetone | Macron Fine Chemicals | 2440-02 | |
| 29-guage syringes | Exel International | 26029 | |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | |
| 70 um cell strainers | VWR | 732-2758 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| HBSS | Caisson | HBL06 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L34966 | |
| Purified Anti-mouse CD16/CD32 | Tonbo Biosciences | 70-0161-M001 | |
| BV605 CD11c (clone N418) | Biolegend | 117334 | |
| PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2) | BD Pharmingen | 562363 | |
| BV421 CD3e (clone 145-2C11) | Biolegend | 100341 | |
| APC CD8a (clone 53-6.7) | TonBo Biosciences | 20-0081-u100 | |
| APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| BV650 CD19 (clone 6D5) | Biolegend | 115541 | |
| PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4) | Biolegend | 128011 | |
| Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8) | Biolegend | 123121 | |
| APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8) | Biolegend | 127623 | |
| BV711 CD11b (clone M1/70) | Biolegend | 101241 | |
| BV605 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103155 | |
| BV711 CD4 (clone RM4-5) | BD Biosciences | 563726 | |
| Bovine serum albumin (Fraction V) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle Set | BD Biosciences | 552845 | |
| Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10 Software | FlowJo |
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