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생물학

Quantificar a saída de leucócitos através de vasos linfáticos da pele murino e tumores

Published: January 07, 2019
doi:
10.3791/58704
, , , , ,
1Department of Cell, Developmental, & Cancer Biology,Oregon Health and Science University, 2Department of Molecular Microbiology & Immunology,Oregon Health and Science University, 3Department of Dermatology,Oregon Health and Science University, 4Knight Cancer Institute,Oregon Health and Science University

Summary

Aqui, demonstramos os métodos para a quantificação na vivo de saída de leucócitos de ingênuo, inflamado e pele murino maligna. Realizamos uma Head-to-comparação de dois modelos: transdermal FITC photoconversion de aplicativo e in situ . Além disso, vamos demonstrar a utilidade da photoconversion para controlar a saída de leucócitos de tumores cutâneos.

Abstract

Saída de leucócitos de tecidos periféricos para drenagem de linfonodos não é somente crítica para vigilância imune e iniciação mas também contribui para a resolução das respostas do tecido periférico. Embora uma variedade de métodos são usados para quantificar a saída de leucócitos de tecidos não-linfoides, periféricos, os mecanismos celulares e moleculares que governam o egresso de contexto-dependente permanecem mal compreendidos. Aqui, descrevemos o uso de photoconversion em situ para análise quantitativa de saída de leucócitos da pele murino e tumores. Photoconversion permite a rotulagem direta de leucócitos residente no tecido cutâneo. Embora a exposição da pele à luz ultravioleta induz local respostas inflamatórias caracterizam por infiltração de leucócitos e leakiness vascular, em uma comparação frente a frente com aplicação transdérmica dos marcadores fluorescentes, photoconversion especificamente rotulado de populações de células dendríticas migratórias e simultaneamente habilitado a quantificação de mieloide e linfoide egresso do microambiente cutâneo e tumores. Os mecanismos de saída de leucócitos mantêm um componente em falta em nossa compreensão da complexidade de leucócitos intratumoral, e, portanto, a aplicação das ferramentas descritas neste documento fornecerá uma visão única da dinâmica do tumor imune microambiente que ambos Só firme estadual e em resposta à terapia.

Introduction

Respostas imunes de tecido periférico são moldadas não apenas por recrutamento de leucócitos para os locais de inflamação, mas também por mecanismos que regulam sua retenção subsequente. Assim, a imunidade protetora é ditada pela cumulativos mecanismos celulares e moleculares que determinam se um leucócito entra, fica dentro, ou melhor migra do tecido periférico, através de vasos linfáticos. Importante, a propensão para leucócitos sair do tecido através de vasos linfáticos (denominado Egresso) está ligada às suas funções especializadas. Células dendríticas (DC) adquirem comportamento migratório, em resposta a sinais de maturação, levando a transporte do antígeno e apresentação na drenagem dos gânglios linfáticos (dLN), um processo que é necessário para a imunidade adaptativa1. Eliminação de células mieloides, tais como os macrófagos e os neutrófilos, servem para limpar escombros apoptotic através da fagocitose. Durante a infecção bacteriana, os neutrófilos saída de tecido e, finalmente, sofrem apoptose em dLNs2 e em um modelo da colite induzida por DSS, dados suporta a hipótese de que o egresso macrófago é necessário para resolver a inflamação local3. No entanto, se o egresso de neutrófilos e macrófagos ocorre em todos os contextos inflamatórios, é desconhecido. Provas para saída de linfócitos T de estado estacionário4,5,6,7, infectados8e inflamada4,9,10, 11,12 periféricos, não-linfoides tecidos indica que células T recircular ativamente, embora os sinais baseados em tecido que impulsionam esta saída permanecem mal compreendidos. Vários estudos têm identificado os sinais necessários para a migração direcional para drenagem linfáticos capilares e subsequentes saída incluindo chemokine (C-C motif) ligand 21 (CCL21) e seu receptor CCR74,11, 13, chemokine (C-X-C motif) ligand 12 (CXCL12) e seu receptor CXCR42,14e esfingosina-1-fosfato (S1P)10,15,16. Estes mecanismos não são ativos em todos os contextos, no entanto, e se eles determinam a saída de todos os tipos de célula permanece uma questão em aberto. Importante, ainda mais insight sobre os mecanismos que regem o egresso e sua relevância funcional na doença requer métodos quantitativos na vivo de análise.

Vários métodos têm sido utilizados para quantificar o egresso em vários modelos animais na vivo incluindo canulação direta dos vasos linfáticos, transferência adotiva de ex vivo rotulado leucócitos, aplicação de transdermal dos marcadores fluorescentes, injeção de partículas rotuladas e na vivo photoconversion17,18. Canulação direta dos vasos linfáticos aferentes do rato é difícil e limitado em pequenos animais pelos volumes de líquido que pode ser recolhido. Assim, canulação em grande parte foi realizada em animais de grandes porte (ex., ovelha) onde tais manipulações cirúrgicas são práticas. Estes estudos fornecem a evidência direta da presença de células linfoides e mieloides em linfa10,19,20. Além disso, modelos de ovinos revelam que inflamação aguda e crônica aumentou a presença de linfócitos na linfa por quase 100 vezes10,21.

Transferência adotiva de linfócitos etiquetados e manipulados geneticamente importante revelou que CCR7 é necessária para a saída dos CD4+ T células de5,da pele inflamada aguda11, enquanto o pré-tratamento dos linfócitos com a pequena molécula agonista do receptor de S1P, FTY720, apenas parcialmente inibe sua saída10. Curiosamente, a saída de linfócitos transferidos de pele cronicamente inflamada é independente CCR710, mas parcialmente pode exigir CXCR49. Experimentos de transferência adotiva, no entanto, entregam números não-fisiológicos da ex vivo ativados e rotulados de linfócitos no tecido através de injeção, que altera o ambiente biomecânico dos tecidos e pressões elevadas de fluido intersticiais que abrir os capilares linfáticos iniciais e alterar suas propriedades de transporte22. Como uma alternativa, aplicação de transdermal de isotiocianato de fluoresceína (FITC) na presença ou ausência de irritantes dérmicas (EG., Dibutilftalato, DBP) ou infecção23,24 permite o acompanhamento das células fagocíticas que acumulam tracer e migram para o dLNs. Da mesma forma, tumores fluorescente etiquetadas fornecem um meio para controlar as células fagocíticas que tem engolido o tumor material25. Esses métodos têm fornecido importantes insights sobre os mecanismos que regem a DC saída13,14,17,26,27 , mas são incapazes de controlar não-fagocíticas linfócitos e, a interpretação podem ser complicadas por drenagem linfática grátis de solúvel FITC rotulando assim não migratória, LN residentes DCs.

Alternativamente, a microscopia intravital é uma ferramenta poderosa que permite o rastreamento no vivo das populações de leucócitos fisiologicamente relevantes em tempo real28,29. Usado em combinação com o repórter ratos e anticorpo-baseado na vivo imunofluorescência etiquetando, intravital microscopia revelou o complexo espacial e temporal dinâmica de imune celular de tráfico, incluindo a migração intersticial30 , transmigração através do endotélio linfático, passagem dentro do lúmen linfática e migração em cima LN entrada28,31. Ampla adoção de técnicas de imagem intravital é limitada pela despesa, conhecimentos necessários para configurar e limitado throughput para quantificação dos vários tipos de células. Ainda, métodos quantitativos que analisam a dinâmica populacional de acoplamento tecidos com intravital imagem irão fornecer uma visão mecanicista adicional e importante no que diz respeito as mecanismos de mobilidade e migração em direção e dentro de capilares linfáticos 18 , 31 , 32.

Por conseguinte, na vivo photoconversion emergiu como um método que permite em situ etiquetando, independente da atividade fagocítica e para a quantificação de saída de leucócitos fisiológica (quando acoplado com citometria de fluxo) na ausência ou presença de desafio. Ratos de Kaede-Tg constitutivamente expressam uma proteína isolada de corais stony que apresenta fluorescência verde (Kaede verde) até expostos à luz violeta, após o qual ele converte irreversivelmente a fluorescência vermelha (Kaede vermelho)33. Photoconverted células podem ser rastreadas como eles saída de sítios de tecidos periféricos e acumular-se no dLNs. Esta e outras semelhantes photoconvertible rato modelos34,35 revelaram importante biologia incluindo egresso constitutivo de pilhas de T reguladoras de pele36, egresso de células B CXCR4-dependente de Peyer37 , mobilização de células de memória residente T após peptídeo re-desafio38e saída de leucócitos amplo de tumor microambiente39. Neste documento, podemos realizar uma comparação frente a frente de photoconversion com aplicação de transdermal FITC no contexto da inflamação cutânea e infecção para permitir a comparação direta dos dados existentes com o método de photoconvertible. Além disso, demonstramos photoconversion em tumores implantados e descrever a eficiência de conversão e saída seletiva do microambiente do tumor. Como tal, podemos argumentar que é necessária mais aplicação destes métodos para elucidar a biologia crítica do egresso de leucócitos de tumores, que terá implicações significativas para interpretar a complexidade de leucócitos intratumoral, imunidade anti-tumoral, e resposta à terapia.

Protocol

Todos os protocolos de animais foram aprovados pelo Comitê de uso no Oregon Health & Science University e institucional Cuidado Animal. 1. indução da inflamação e FITC pintura de Mouse Pinna Em uma capa de fluxo laminar, anestesiar um rato C57Bl/6 utilizando isofluorano vaporizado (induzir no 3-5% isofluorano e manter-se em 1-3% isofluorano; taxa de fluxo de oxigênio em 0,5-1,0 L/min). Assegurar a adequada anesthetization monitorando a perda do reflexo de pedal, movimentos invo…

Representative Results

Primeiro procuramos replicar photoconversion resultados publicados na literatura para avaliar a eficiência e determinar a inflamação associada na pele do rato. O pavilhão auricular orelha foi exposto a 100 mW violeta luz (405 nm) para 3 min como anteriormente descrito33. Único suspensões celulares geradas a partir de pele de orelha ou cervical dLNs imediatamente após a exposição revelaram uma eficiência de conversão de 78% de todos os CD45+ le…

Discussion

Embora a saída de leucócitos de tecidos não-linfoides, periféricos é fundamental para a iniciação e a resolução de respostas imunes, os mecanismos moleculares que governam o egresso são mal compreendidos. Esta lacuna no conhecimento é em grande parte devido à pronta disponibilidade de ferramentas para a quantificação em vivo. Aqui, descrevemos o uso de ratos de photoconvertible (Kaede-Tg) para quantificar a saída de leucócitos endógeno da pele e tumores e fornecer uma comparação direta de fren…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostaria de agradecer o Dr. Marcus Bosenberg para fornecer YUMM 1.1 e 1.7 YUMM linhas de melanoma murino e Dr. Deborah J. Fowell para fornecer B6. CG-Tg(CAG-tdKaede) 15Utr ratos de acordo com a RIKEN BRC através do Bio-recurso nacional do MEXT, Japão.

Materials

Collagenase D Roche 11088866001
DNase Roche 4536282001
Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtor Prizmatix Ltd V8144
Fluorescein isothiocyanate isomer I Sigma-Aldrich F4274
dibutyl phthalate Sigma-Aldrich 524980
acetone Macron Fine Chemicals 2440-02
29-guage syringes Exel International 26029
Evans Blue Sigma-Aldrich E2129
70 um cell strainers VWR 732-2758
paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
HBSS Caisson HBL06
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit Invitrogen L34966
Purified Anti-mouse CD16/CD32 Tonbo Biosciences 70-0161-M001
BV605 CD11c (clone N418) Biolegend 117334
PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2) BD Pharmingen 562363
BV421 CD3e (clone 145-2C11) Biolegend 100341
APC CD8a (clone 53-6.7) TonBo Biosciences 20-0081-u100
APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11) Biolegend 103116
BV650 CD19 (clone 6D5) Biolegend 115541
PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4) Biolegend 128011
Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8) Biolegend 123121
APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8) Biolegend 127623
BV711 CD11b (clone M1/70) Biolegend 101241
BV605 CD45 (clone 30-F11) Biolegend 103155
BV711 CD4 (clone RM4-5) BD Biosciences 563726
Bovine serum albumin (Fraction V) Fisher Scientific BP1600-100
Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle Set BD Biosciences 552845
Fortessa Flow Cytometer BD Biosciences
FlowJo v10 Software FlowJo
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References

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Steele, M. M., Churchill, M. J., Breazeale, A. P., Lane, R. S., Nelson, N. A., Lund, A. W. Quantifying Leukocyte Egress via Lymphatic Vessels from Murine Skin and Tumors. J. Vis. Exp. (143), e58704, doi:10.3791/58704 (2019).
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