JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생물학

Kvantifiera leukocyt avstigning via lymfkärl från murina hud och tumörer

Published: January 07, 2019
doi:
10.3791/58704
, , , , ,
1Department of Cell, Developmental, & Cancer Biology,Oregon Health and Science University, 2Department of Molecular Microbiology & Immunology,Oregon Health and Science University, 3Department of Dermatology,Oregon Health and Science University, 4Knight Cancer Institute,Oregon Health and Science University

Summary

Här visar vi metoderna för in-vivo kvantifiering av leukocyt avstigning från naiva, inflammerad, och maligna murina hud. Vi utför en head-to-head jämförelse av två modeller: transdermal FITC ansökan och i situ photoconversion. Vi visar dessutom nyttan av photoconversion för att spåra leukocyt avstigning från kutana tumörer.

Abstract

Leukocyt avstigning från perifera vävnader till dränerande lymfkörtlar är inte bara avgörande för immun övervakning och initiering utan bidrar även till resolution av perifer vävnad svaren. Medan en mängd metoder används för att kvantifiera leukocyt avstigning från icke-lymfoida, perifera vävnader, förblir de cellulära och molekylära mekanismer som reglerar innehållsberoende avstigning dåligt förstådd. Här, beskriver vi användningen av i situ photoconversion för kvantitativ analys av leukocyt avstigning från murina hud och tumörer. Photoconversion möjliggör direkt märkning av leukocyter bosatta inom kutan tissue. Om huden utsätts för ultraviolett ljus inducerar lokala kännetecknas inflammatoriska svar av leukocyt infiltrat och vaskulära leakiness, i en head-to-head jämförelse med transdermal applikation av fluorescerande spårämnen, photoconversion specifikt märkt flyttande dendritiska cellpopulationer och samtidigt aktiverade kvantifiering av myeloiska och lymfoida avstigning från kutana mikromiljö och tumörer. Mekanismer för egress leukocyt förbli en komponent som saknas i vår förståelse av intratumoral leukocyt komplexitet och således tillämpningen av verktygen som beskrivs häri ger unik insikt i dynamiken i tumör immun mikromiljö båda vid steady state och som svar på behandling.

Introduction

Perifer vävnad immunsvar formas inte bara av leukocyt rekrytering till platser av inflammation, men också av mekanismer som reglerar deras efterföljande kvarhållandet. Skyddande immunitet styrs således av kumulativa cellulära och molekylära mekanismer som avgör huruvida en leukocyt träder, vistelser inom, eller snarare migrerar ut ur perifer vävnad via lymfkärl. Ännu viktigare, är benägenheten för leukocyter att avsluta vävnad genom lymfkärl (kallas avstigning) kopplad till sina specialiserade funktioner. Dendritiska celler (DC) förvärva flyttande beteende som svar till mognad signaler leder till antigen transport och presentation i dränerande lymfkörtlar (dLN), en process som är nödvändig för adaptiv immunitet1. Rensning myeloida celler, såsom makrofager och neutrofiler, tjäna till att rensa apoptotiska skräp genom fagocytos. Under bakterieinfektion, neutrofiler avstigning vävnad och slutligen genomgå apoptos i dLNs2 och en modell av DSS-inducerad kolit, data stödjer hypotesen att makrofag avstigning är nödvändigt att lösa lokal inflammation3. Om antal neutrofiler och makrofager avstigning uppstår i alla inflammatoriska sammanhang är dock okänd. Bevis för T-lymfocyter avstigning från steady state4,5,6,7, infekterade8och inflammerade4,9,10, 11,12 perifer, icke-lymfoida vävnader indikerar att återcirkulera aktivt T-celler, men de tissue-baserade signaler som kör denna avfart förblir dåligt förstådd. Flera studier har identifierat signaler behövs för riktad övergång till dränering lymfatiska kapillärer och efterföljande avstigning inklusive chemokine (C-C motiv) ligand 21 (CCL21) och dess receptor CCR74,11, 13, chemokine (C-X-C motiv) ligand 12 (CXCL12) och dess receptor CXCR42,14, och sfingosin-1-fosfat-(S1P)10,15,16. Dessa mekanismer är inte aktiva i alla sammanhang dock och huruvida de fastställa avstigning av alla celltyper förblir en öppen fråga. Ännu viktigare, ytterligare kräver insikt om de mekanismer som reglerar avstigning och dess funktionella relevans i sjukdom kvantitativa i vivo analysmetoder.

Flera metoder har använts för att kvantifiera avstigning i flera djurmodeller i vivo inklusive direkta kanylering av lymfkärl, överföring av ex vivo märkta leukocyter, transdermal applikation av fluorescerande spårämnen, injektion av märkta partiklar och i vivo photoconversion17,18. Direkta kanylering av afferenta mus lymfkärl är svårt och begränsad i små djur av volymerna av vätska som kan samlas in. Kanylering har således till stor del utförts i stora djur (t.ex., får) där sådana kirurgiska manipulationer är praktiska. Dessa studier ger direkta bevis för förekomsten av både lymfoida och myeloida celler i lymfan10,19,20. Dessutom avslöjar får modeller att akut och kronisk inflammation ökade nästan 100 gånger10,21lymfocyter närvaro i lymfan.

Överföring av märkta och genetiskt manipulerade lymfocyter har allt avslöjat att CCR7 krävs för avstigning av CD4+ T celler från akut inflammerad hud5,11, medan förbehandling av lymfocyter med små molekylen S1P-receptoragonist hämmar FTY720, endast delvis sina avstigning10. Intressant, avstigning av överförda lymfocyter från kroniskt inflammerad hud är CCR7-oberoende10, men kräva delvis CXCR49. Överföring experiment, dock leverera icke-fysiologiskt antal ex vivo aktiveras och märkta lymfocyter in vävnaden genom injektion, vilket förändrar den biomekaniska miljön av vävnader och förhöjda interstitiell vätska tryck som öppna inledande lymfatiska kapillärer och förändra deras transport boenden22. Som ett alternativ, transdermal applicering av fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC) i närvaro eller frånvaro av dermal irriterande (t.ex., dibutylftalat, DBP) eller infektion23,24 möjliggör spårning av Fagocytos celler som ackumuleras tracer och migrera till dLNs. Likaså ger fluorescently märkt tumörer ett sätt att spåra Fagocytos celler som har uppslukat tumör material25. Dessa metoder har gett viktig insikt om de mekanismer som styr DC utgång13,14,17,26,27 men inte kan spåra icke-fagocytos lymfocyter och tolkning kan kompliceras av gratis lymfdränage av lösliga FITC således märkning stannfågel, LN bosatt DCs.

Alternativt, intravital mikroskopi är ett kraftfullt verktyg som möjliggör in-vivo spårning av fysiologiskt relevanta leukocyt populationer i realtid28,29. Används i kombination med reporter möss och antikroppsbaserade i vivo märkning Immunofluorescerande, intravital mikroskopi har avslöjat komplexet rumsliga och tidsmässiga dynamiken i immun cell människohandel, inklusive interstitiell migration30 , själavandring över de lymfatiska endotelet, passage inom lymfatiska lumen och migration på LN post28,31. Brett antagandet av intravital avbildningstekniker begränsas av bekostnad, nödvändig expertis för uppsättning upp, och begränsade genomströmning för att kvantifiera flera celltyper. Fortfarande, koppling kvantitativa metoder att analyserar populationsdynamik vävnader med intravital imaging kommer att ge ytterligare och viktiga mekanistisk insikt beträffande mekanismer motilitet och migration mot och inom lymfatiska kapillärer 18 , 31 , 32.

Följaktligen i vivo photoconversion har vuxit fram som en metod som möjliggör i situ märkning, oberoende av fagocytiska aktiviteten, och för kvantifiering av fysiologiska leukocyt avstigning (när den kombineras med flödescytometri) i den avsaknaden eller förekomsten av utmaning. Kaede-Tg möss express konstitutivt ett protein som isolerats från stenig korallrev som uppvisar grön fluorescens (Kaede grön) tills utsätts för ultraviolett ljus, varefter det irreversibelt konverterar till röd fluorescens (Kaede röd)33. Photoconverted celler kan spåras som de avstigning från perifer vävnad webbplatser och ackumuleras i dLNs. Detta och andra liknande photoconvertible mus modeller34,35 har avslöjat viktig biologi inklusive konstituerande avstigning av regulatoriska T-celler från huden36, CXCR4-beroende B cell avstigning från Peyers37 , mobilisering av resident T minnesceller vid peptid rechallenge38och bred leukocyt avstigning från tumör mikromiljö39. Häri, utför vi en head-to-head jämförelse av photoconversion med transdermal FITC ansökan i samband med kutan inflammation och infektion som möjliggör direkt jämförelse av befintliga data med metoden photoconvertible. Dessutom vi demonstrera photoconversion i implanterade tumörer och beskriva verkningsgraden och selektiv avstigning från tumör mikromiljö. Som sådan, hävdar vi att ytterligare tillämpning av dessa metoder krävs att belysa leukocyt avstigning från tumörer, som kommer att ha betydande konsekvenser för att tolka intratumoral leukocyt komplexitet, anti-tumor immunitet, kritiska biologi och behandlingssvaret.

Protocol

Alla djur protokoll har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén på Oregon Health & Science University. 1. induktion av Inflammation och FITC målning av mus Pinna I en LAF, söva en C57Bl/6 mus med förångade isofluorane (framkalla på 3-5% isofluorane och underhålla på 1-3% isofluorane; syre flöde på 0,5-1,0 L/min). Säkerställa korrekt anesthetization genom att övervaka förlusten av pedal reflexen, ofrivilliga rörelser och nedsatt andningsfr…

Representative Results

Vi försökte först replikera photoconversion resultat publicerade i litteraturen att utvärdera effektiviteten och bestämma den associerade inflammationen i mus huden. Den öra pinna utsattes för 100 mW violett ljus (405 nm) för 3 min som tidigare beskrivs33. Enstaka cellsuspensioner genereras från örat hud eller cervikal dLNs omedelbart efter exponeringen visade en 78% verkningsgrad för alla CD45+ leukocyter i huden med inga konverterade celler …

Discussion

Även om den leukocyt avstigning från perifera, icke-lymfoida vävnader är kritiska för initiering och upplösning av immunreaktioner, är de molekylära mekanismer som reglerar avstigning dåligt känd. Denna lucka i kunskap beror till stor del på tillgången av verktyg för kvantifiering i vivo. Här, beskriver vi användningen av photoconvertible möss (Kaede-Tg) för att kvantifiera endogena leukocyt avstigning från huden och tumörer och ge en direkt head-to-head jämförelse med FITC färg i inflammat…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Författarna vill tacka Dr Marcus Bosenberg för att tillhandahålla YUMM 1.1 och YUMM 1,7 murina melanom linjer och Dr Deborah J. Fowell för att tillhandahålla B6. CG-Tg(CAG-tdKaede) 15Utr möss i samförstånd med RIKEN BRC genom nationella Bio-resursen i MEXT, Japan.

Materials

Collagenase D Roche 11088866001
DNase Roche 4536282001
Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtor Prizmatix Ltd V8144
Fluorescein isothiocyanate isomer I Sigma-Aldrich F4274
dibutyl phthalate Sigma-Aldrich 524980
acetone Macron Fine Chemicals 2440-02
29-guage syringes Exel International 26029
Evans Blue Sigma-Aldrich E2129
70 um cell strainers VWR 732-2758
paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
HBSS Caisson HBL06
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit Invitrogen L34966
Purified Anti-mouse CD16/CD32 Tonbo Biosciences 70-0161-M001
BV605 CD11c (clone N418) Biolegend 117334
PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2) BD Pharmingen 562363
BV421 CD3e (clone 145-2C11) Biolegend 100341
APC CD8a (clone 53-6.7) TonBo Biosciences 20-0081-u100
APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11) Biolegend 103116
BV650 CD19 (clone 6D5) Biolegend 115541
PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4) Biolegend 128011
Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8) Biolegend 123121
APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8) Biolegend 127623
BV711 CD11b (clone M1/70) Biolegend 101241
BV605 CD45 (clone 30-F11) Biolegend 103155
BV711 CD4 (clone RM4-5) BD Biosciences 563726
Bovine serum albumin (Fraction V) Fisher Scientific BP1600-100
Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle Set BD Biosciences 552845
Fortessa Flow Cytometer BD Biosciences
FlowJo v10 Software FlowJo
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
  2. Hampton, H. R., Bailey, J., Tomura, M., Brink, R., Chtanova, T. Microbe-dependent lymphatic migration of neutrophils modulates lymphocyte proliferation in lymph nodes. Nature Communications. 6, 7139 (2015).
  3. D’Alessio, S., et al. VEGF-C-dependent stimulation of lymphatic function ameliorates experimental inflammatory bowel disease. Journal of Clinical Investigation. 124 (9), 3863-3878 (2014).
  4. Debes, G. F., et al. Chemokine receptor CCR7 required for T lymphocyte exit from peripheral tissues. Nature Immunology. 6 (9), 889-894 (2005).
  5. Bromley, S. K., Yan, S., Tomura, M., Kanagawa, O., Luster, A. D. Recirculating memory T cells are a unique subset of CD4+ T cells with a distinct phenotype and migratory pattern. Journal of Immunology. 190 (3), 970-976 (2013).
  6. Tomura, M., et al. Activated regulatory T cells are the major T cell type emigrating from the skin during a cutaneous immune response in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (3), 883-893 (2010).
  7. Tomura, M., Itoh, K., Kanagawa, O. Naive CD4+ T lymphocytes circulate through lymphoid organs to interact with endogenous antigens and upregulate their function. Journal of Immunology. 184 (9), 4646-4653 (2010).
  8. Jennrich, S., Lee, M. H., Lynn, R. C., Dewberry, K., Debes, G. F. Tissue exit: a novel control point in the accumulation of antigen-specific CD8 T cells in the influenza a virus-infected lung. Journal of Virology. 86 (7), 3436-3445 (2012).
  9. Geherin, S. A., Wilson, R. P., Jennrich, S., Debes, G. F. CXCR4 is dispensable for T cell egress from chronically inflamed skin via the afferent lymph. PLoS One. 9 (4), e95626 (2014).
  10. Brown, M. N., et al. Chemoattractant receptors and lymphocyte egress from extralymphoid tissue: changing requirements during the course of inflammation. Journal of Immunology. 185 (8), 4873-4882 (2010).
  11. Bromley, S. K., Thomas, S. Y., Luster, A. D. Chemokine receptor CCR7 guides T cell exit from peripheral tissues and entry into afferent lymphatics. Nature Immunology. 6 (9), 895-901 (2005).
  12. Gomez, D., Diehl, M. C., Crosby, E. J., Weinkopff, T., Debes, G. F. Effector T Cell Egress via Afferent Lymph Modulates Local Tissue Inflammation. Journal of Immunology. 195 (8), 3531-3536 (2015).
  13. Ohl, L., et al. CCR7 governs skin dendritic cell migration under inflammatory and steady-state conditions. Immunity. 21 (2), 279-288 (2004).
  14. Kabashima, K., et al. CXCL12-CXCR4 engagement is required for migration of cutaneous dendritic cells. American Journal of Pathology. 171 (4), 1249-1257 (2007).
  15. Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Review of Immunology. 30, 69-94 (2012).
  16. Matloubian, M., et al. Lymphocyte egress from thymus and peripheral lymphoid organs is dependent on S1P receptor 1. Nature. 427 (6972), 355-360 (2004).
  17. Teijeira, A., Rouzaut, A., Melero, I. Initial afferent lymphatic vessels controlling outbound leukocyte traffic from skin to lymph nodes. Frontiers in Immunology. 4, 433 (2013).
  18. Hunter, M. C., Teijeira, A., Halin, C. T Cell Trafficking through Lymphatic Vessels. Frontiers in Immunology. 7, 613 (2016).
  19. Bujdoso, R., Hopkins, J., Dutia, B. M., Young, P., McConnell, I. Characterization of sheep afferent lymph dendritic cells and their role in antigen carriage. Journal of Experimental Medicine. 170 (4), 1285-1301 (1989).
  20. Young, A. J. The physiology of lymphocyte migration through the single lymph node in vivo. Seminars in Immunology. 11 (2), 73-83 (1999).
  21. Seabrook, T., et al. The traffic of resting lymphocytes through delayed hypersensitivity and chronic inflammatory lesions: a dynamic equilibrium. Seminars in Immunology. 11 (2), 115-123 (1999).
  22. Swartz, M. A., et al. Mechanics of interstitial-lymphatic fluid transport: theoretical foundation and experimental validation. Journal of Biomechanics. 32 (12), 1297-1307 (1999).
  23. Macatonia, S. E., Knight, S. C., Edwards, A. J., Griffiths, S., Fryer, P. Localization of antigen on lymph node dendritic cells after exposure to the contact sensitizer fluorescein isothiocyanate. Functional and morphological studies. Journal of Experimental Medicine. 166 (6), 1654-1667 (1987).
  24. Robbiani, D. F., et al. The leukotriene C(4) transporter MRP1 regulates CCL19 (MIP-3beta, ELC)-dependent mobilization of dendritic cells to lymph nodes. Cell. 103 (4), 757-768 (2000).
  25. Roberts, E. W., et al. Critical Role for CD103(+)/CD141(+) Dendritic Cells Bearing CCR7 for Tumor Antigen Trafficking and Priming of T Cell Immunity in Melanoma. Cancer Cell. 30 (2), 324-336 (2016).
  26. Forster, R., et al. CCR7 coordinates the primary immune response by establishing functional microenvironments in secondary lymphoid organs. Cell. 99 (1), 23-33 (1999).
  27. Johnson, L. A., Jackson, D. G. The chemokine CX3CL1 promotes trafficking of dendritic cells through inflamed lymphatics. Journal of Cell Science. 126, 5259-5270 (2013).
  28. Teijeira, A., et al. T Cell Migration from Inflamed Skin to Draining Lymph Nodes Requires Intralymphatic Crawling Supported by ICAM-1/LFA-1 Interactions. Cell Reports. 18 (4), 857-865 (2017).
  29. Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8 (2), e57135 (2013).
  30. Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin alphaV. Nature Immunology. 14 (9), 949-958 (2013).
  31. Russo, E., et al. Intralymphatic CCL21 Promotes Tissue Egress of Dendritic Cells through Afferent Lymphatic Vessels. Cell Reports. 14 (7), 1723-1734 (2016).
  32. Steven, P., Bock, F., Huttmann, G., Cursiefen, C. Intravital two-photon microscopy of immune cell dynamics in corneal lymphatic vessels. PLoS One. 6 (10), e26253 (2011).
  33. Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 105 (31), 10871-10876 (2008).
  34. Shand, F. H., et al. Tracking of intertissue migration reveals the origins of tumor-infiltrating monocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (21), 7771-7776 (2014).
  35. Tomura, M., et al. Tracking and quantification of dendritic cell migration and antigen trafficking between the skin and lymph nodes. Scientific Reports. 4, 6030 (2014).
  36. Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. Journal of Experimental Medicine. 208 (6), 1279-1289 (2011).
  37. Schmidt, T. H., Bannard, O., Gray, E. E., Cyster, J. G. CXCR4 promotes B cell egress from Peyer’s patches. Journal of Experimental Medicine. 210 (6), 1099-1107 (2013).
  38. Beura, L. K., et al. T Cells in Nonlymphoid Tissues Give Rise to Lymph-Node-Resident Memory T Cells. Immunity. 48 (2), 327-338 (2018).
  39. Torcellan, T., et al. In vivo photolabeling of tumor-infiltrating cells reveals highly regulated egress of T-cell subsets from tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (22), 5677-5682 (2017).
  40. Khan, T. N., Mooster, J. L., Kilgore, A. M., Osborn, J. F., Nolz, J. C. Local antigen in nonlymphoid tissue promotes resident memory CD8+ T cell formation during viral infection. Journal of Experimental Medicine. 213 (6), 951-966 (2016).
  41. Loo, C. P., et al. Lymphatic Vessels Balance Viral Dissemination and Immune Activation following Cutaneous Viral Infection. Cell Reports. 20 (13), 3176-3187 (2017).
  42. Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. (73), e50062 (2013).
  43. Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (18), 6696-6701 (2014).
  44. Meeth, K., Wang, J. X., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations. Pigment Cell Melanoma Research. 29 (5), 590-597 (2016).
  45. Demkowicz, W. E., Littaua, R. A., Wang, J., Ennis, F. A. Human cytotoxic T-cell memory: long-lived responses to vaccinia virus. Journal of Virology. 70 (4), 2627-2631 (1996).
  46. Stewart, A. J., Devlin, P. M. The history of the smallpox vaccine. Journal of Infection. 52 (5), 329-334 (2006).
  47. Hammarlund, E., et al. Duration of antiviral immunity after smallpox vaccination. Nature Medicine. 9 (9), 1131-1137 (2003).
  48. Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
  49. Tomura, M., Kabashima, K. Analysis of cell movement between skin and other anatomical sites in vivo using photoconvertible fluorescent protein "Kaede"-transgenic mice. Methods in Molecular Biology. , 279-286 (2013).
  50. Bellingan, G. J., Caldwell, H., Howie, S. E., Dransfield, I., Haslett, C. In vivo fate of the inflammatory macrophage during the resolution of inflammation: inflammatory macrophages do not die locally, but emigrate to the draining lymph nodes. Journal of Immunology. 157 (6), 2577-2585 (1996).
  51. Gautier, E. L., Ivanov, S., Lesnik, P., Randolph, G. J. Local apoptosis mediates clearance of macrophages from resolving inflammation in mice. Blood. 122 (15), 2714-2722 (2013).
  52. Abadie, V., et al. Neutrophils rapidly migrate via lymphatics after Mycobacterium bovis BCG intradermal vaccination and shuttle live bacilli to the draining lymph nodes. Blood. 106 (5), 1843-1850 (2005).
  53. Beauvillain, C., et al. CCR7 is involved in the migration of neutrophils to lymph nodes. Blood. 117 (4), 1196-1204 (2011).
  54. Rigby, D. A., Ferguson, D. J., Johnson, L. A., Jackson, D. G. Neutrophils rapidly transit inflamed lymphatic vessel endothelium via integrin-dependent proteolysis and lipoxin-induced junctional retraction. Journal of Leukocyte Biology. 98 (6), 897-912 (2015).
  55. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  56. Binnewies, M., et al. Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy. Nature Medicine. 24 (5), 541-550 (2018).

Tags

Leukocyte EgressLymphatic VesselsMurine SkinTumorsPhotoconversionIn VivoQuantitative AnalysisLeukocyte ResidenceExit DynamicsDisease StatesCutaneous TumorsInflammationKaede Transgenic MouseDibutyl PhthalateVaccinia InfectionLymph NodesCollagenase DDNaseCell Suspension
check_url/kr/58704?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Steele, M. M., Churchill, M. J., Breazeale, A. P., Lane, R. S., Nelson, N. A., Lund, A. W. Quantifying Leukocyte Egress via Lymphatic Vessels from Murine Skin and Tumors. J. Vis. Exp. (143), e58704, doi:10.3791/58704 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image