تحقيق تبعيات الجينية باستخدام فحوصات كريسبر-Cas9-تعتمد المنافسة
Summary
هذه المخطوطة وصف أسلوب كريسبر-Cas9-تعتمد متفاوت بانتظام إينتيرسباسيد قصيرة المتناوب يكرر (كريسبر) للتحقيق بسيطة وسريعة لدور متعددة الجينات المرشحة في سرطان الدم النقوي الحاد (AML) انتشار الخلايا في موازية. هذه التقنية قابلة للتطوير ويمكن تطبيقها في خطوط خلايا السرطان الأخرى كذلك.
Abstract
وقد استخدمت الدراسات اضطراب الجينات على نطاق واسع التحقيق في دور الجينات الفردية في أمراض مكافحة غسل الأموال. لتحقيق اضطراب الجينات كاملة، قد جعلت العديد من هذه الدراسات استخدام نماذج خروج المغلوب الجينات المعقدة. في حين تقدم هذه الدراسات مع خروج المغلوب الفئران نظاما للتحقيق في علاقات التركيب الوراثي للنمط الظاهري أنيقة واجتازت اختبار الزمن، طريقة سريعة وقابلة للتطوير لتقييم المرشح الجينات التي تلعب دوراً في انتشار خلية مكافحة غسل الأموال أو البقاء على قيد الحياة في نماذج مكافحة غسل الأموال سيساعد على التعجيل باستجواب موازية متعددة الجينات المرشحة. وعززت التقدم الذي أحرز مؤخرا في تكنولوجيا الجينوم تحرير كبير قدرتنا على أداء الاضطرابات الوراثية على نطاق لم يسبق له مثيل. واحد مثل هذا النظام لتحرير الجينوم هو الأسلوب كريسبر-Cas9-تعتمد التي يمكن استخدامها لإجراء تغييرات سريعة وفعالة في جينوم الخلية المستهدفة. بسهولة وقابلية لحذف الجينات كريسبر/Cas9-بوساطة يجعلها واحدة من التقنيات الأكثر جاذبية لاستجواب عدد كبير من الجينات في فحوصات المظهرية. هنا، فإننا نعرض مقايسة بسيطة باستخدام كريسبر/Cas9 بوساطة الجينات-تعطل جنبا إلى جنب مع المنافسة القائمة على التدفق الخلوي الفائق فحوصات للتحقيق في دور الجينات التي قد تلعب دوراً هاما في انتشار أو البقاء على قيد الحياة للإنسان و موريني خطوط خلية مكافحة غسل الأموال.
Introduction
وشهدت العقود القليلة الماضية جهود بحثية عديدة ركزت على تحديد مساهمة رئيسية المسارات الجزيئية في أمراض سرطان الدم النقوي الحاد (مكافحة غسل الأموال). تقليديا، تم أداء تعطيل الجينات في خلايا مكافحة غسل الأموال باستخدام الفئران خروج المغلوب الشرطي أو دبوس الشعر القصير الحمض النووي الريبي (شرنا). بينما الفئران خروج المغلوب توفر نظام متطور لمراقبة الزمانية للجينات-الحذف، توليد جينات الفئران خروج المغلوب ذات العمالة الكثيفة، وتستغرق وقتاً طويلاً ومكلفة. وعلاوة على ذلك، جين-الضربة القاضية باستخدام استراتيجيات جزئ ليست قابلة للتطوير بسهولة؛ هذه الاستراتيجيات لا تصلح أيضا لاستجواب جينات عدة بالتوازي. وبعد اكتشاف أساليب تدخل الجيش الملكي النيبالي إلى مرناس الذاتية تدق لأسفل باستخدام الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة (siRNA) أو شرنا، بدأت العديد من المجموعات باستخدام تقنيات الحمض النووي الريبي التدخل للتحقيق في دور جينات محددة في مجال مكافحة غسل الأموال. منذ خلايا مكافحة غسل الأموال مورين والبشرية على السواء، يصعب ترانسفيكت باستخدام الأساليب التقليدية تعداء على أساس المادة الدهنية، معظم الدراسات شرنا العاملين لينتيفيرالي أو ترميز ريتروفيرالي لدراسة وظيفة الجينات في خلايا مكافحة غسل الأموال. الاكتشاف الأخير لتجمع يكرر المتناوب القصير إينتيرسباسيد بانتظام (كريسبر) وثورة nucleases Cas المرتبطة بها (كريسبر-Cas9) استهداف الجين التكنولوجيات1،،من23. استخدام كريسبر-Cas9، جينات معينة أو مناطق الجينوم يمكن حذف، وتحرير أو الموسومة بكفاءة وسهولة. كريسبر-Cas9-تعتمد تحرير الجينات يظهر الآن كأسلوب الاختيار للتحقيق في علاقات التركيب الوراثي للنمط الظاهري في أنواع الخلايا المختلفة بسبب البساطة والفعالية، وانطباق واسع النطاق لهذا الأسلوب. كما أصبحت أساليب كريسبر-Cas9-تعتمد الأسلوب المفضل في مكافحة غسل الأموال، ليس فقط لاستجواب الجينات الفردية، ولكن أيضا كوسيلة لاستهداف جينات متعددة في الشاشات الوراثية المنتشرة أو المجمعة بهدف التحقيق في جينات عدة بالتوازي إمكانات مكافحة غسل الأموال-تبعيات4،،من56.
في هذه المخطوطة، يصف لنا مقايسة نمو تنافسي بسيطة لقياس أثر اضطراب الجينات في نمو خلايا مكافحة غسل الأموال، استناداً إلى مستقر كريسبر-Cas9-بوساطة الجينات تحرير تليها الفائق التدفق الخلوي. هذا الأسلوب بسيطة وفعالة، وقابلة للتطوير للتجارب الإنتاجية المتوسطة للتحقيق في دور الجينات عدة بالتوازي في خلايا مكافحة غسل الأموال.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المخطوطة، يمكننا وصف بروتوكول مفصلة للقيام فحص كريسبر-Cas9-تعتمد نمو تنافسي التحقيق في دور الجينات المرشحة في خطوط خلية مكافحة غسل الأموال باستخدام التدفق الخلوي في الخلايا البشرية/الفاري مكافحة غسل الأموال (الشكل 5). الهدف المتمثل التحليل تحديد تأثير حذف الجينات في ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بلازميد pCW-Cas9 وكان هدية من إريك لاندر & ديفيد ساباتيني (بلازميد أدجيني # 50661) و (بسي)-PGKpuro2ABFP-pKLV2-U6gRNA5 ث بلازميد من مختبر يوسا (بلازميد أدجيني #67974. نود أن أشكر الأساسية “التدفق الخلوي” في معهد الاستراتيجية والخطة الاستشرافية الاكتشاف الطبي للمساعدة في الوقت المناسب مع تحليل تدفق والفرز. ونود أن نعترف بالدعم من “مؤسسة النصب التذكاري تاتا سيدة” إلى ميلادي ونود أن نعترف أيضا بدعم مصادر التمويل التالية: المعاهد الوطنية للصحة/NCI P30 CA030199 السرطان مركز رعاية منحة، والخامس-المؤسسة ومراكز السرطان NCI سان دييغو (C3) #PTC2017to A.J.D.
Materials
| FLAG-M2 Antibody | sigma-aldrich | F3165, lot # SLBS3530V | |
| Anti-mouse Antibody | Invitrogen | 31446, lot # TA2514341 | |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Fisher | 34095 | |
| ChemiDoc Imaging System | BIO RAD | 17001401 | |
| Sorvall Legend RT centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Blasticidin | Thermo Fisher | R21001 | |
| SYTOX Red | Thermo Fisher | S34859 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875-093 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | SAFC | 12303C | |
| single gRNA vector | Addgene #67974 | pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W | |
| CelLytic Nuclear extraction kit | sigma-alorich | NXTRACT | |
| XtremeGENE 9 | sigma-alorich | 6365787001 | |
| Retronectin | Takara | T100B | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| T4 PNK | NEBioLabs | M0201S | |
| T4 DNA ligation buffer | NEBioLabs | B0202S | |
| T4 DNA Ligase enzyme | NEBioLabs | M0202S | |
| Ampicillin | Fisher scientific | BP1760-25 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP9724-500 | |
| LB Broth | Fisher scientific | BP9731-500 | |
| Qiagen mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher | NanoDrop One | |
| Recombinant Murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant Murine M-CSF | Peprotech | 315-02 | |
| Stable competent cells | NEBiolabs | C3040I | |
| 10 cm Tissue Culture dishes | Fisher Scientific | 353003 | |
| Cell lysis solution | Qiagen | 158906 | |
| Protein precipitation solution | Qiagen | 158910 | |
| DNA hydration solution | Qiagen | 158914 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| BbSI | New England BioLabs | R0539S | |
| APEX 2.0 X Taq Red Master Mix Kit | Genessee Scientific | 42-138 | |
| Puromycin | Fisher scientific | BP2956100 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495949A | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495970C |
References
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Shi, J., et al. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).
- Kuhn, M. W., et al. Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia. Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).
- Erb, M. A., et al. Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia. Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Brinkman, E. K., et al. Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Research. 46 (10), 58 (2018).
- Nguyen, A. T., Zhang, Y. The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation. Genes & Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).
- Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).
- Bernt, K. M., et al. MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L. Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).
- Daigle, S. R., et al. Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor. Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).
- Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation. Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).
- Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis. Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).
- Zuber, J., et al. Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi. Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
- Li, M. J., Rossi, J. J. Lentivirus transduction of hematopoietic cells. CSH Protocols. 2007, (2007).
