Роман процесс для 3D печати Decellularized матрицы
Summary
Этот протокол описывает производства поликапролактон (PCL) накаливания с встроенных полимолочной кислоты (НОАК) микросферы, которые содержат decellularized матрицы (DM) для 3D печати структурные ткани, инженерные конструкции.
Abstract
3D подложке стремится создавать пользовательские леса, которые являются биологически активных и разместить желаемого размера и геометрии. Термопластичные позвоночника может обеспечить механическую стабильность похож на родной ткани, хотя биологические агенты предлагают композиционные подсказки для клеток-предшественников, привело к их миграции, пролиферации и дифференцирования для воссоздания оригинального тканей / 1,органов2. К сожалению многие 3D печати совместимый, салфетка полимеры (например полимолочной кислоты, PLA) печатных при температуре 210 ° C или выше – температуры, наносят ущерб биопрепаратов. С другой стороны является поликапролактон (PCL), другой тип полиэстер, салфетка, 3D печати материал, который мягче печати Температура 65 ° C. Таким образом, он был предположили, что decellularized внеклеточная матрица (DM), содержащихся в термически защитный барьер PLA могут быть напечатаны в PCL накаливания и остаются в его функциональных конформации. В этой работе ремонт остеохондральные был приложение, для которого был испытан гипотеза. Таким образом свинину хрящ был decellularized и инкапсулируются в полимолочной кислоты (НОАК) микросферы, которые были затем экструдированного с поликапролактон (PCL) в накаливания производить 3D конструкций через плавленый моделирование осаждения. Конструкции с или без микросферы (PLA-DM/PCL и PCL(-), соответственно) были оценены для различий в особенности поверхности.
Introduction
Текущий тканей инженерные методы клинических приложений, таких как кости, хрящи, сухожилия и связки реконструкции использовать авто – и аллотрансплантантов для восстановления поврежденных тканей. Каждый из этих методов осуществляется регулярно как «золотой стандарт» в клинической практике сначала заготовка донорской ткани из больного или трупной матч и затем помещая тканей донора в дефект сайта2. Однако эти стратегии ограничены доноров сайте заболеваемости, нехватка сайт доноров для крупных дефектов, риск инфекции и трудности в поиске имплантатов, которые соответствуют требуемой геометрии. Кроме того исследования показали, что аллотрансплантация тканей, используемых для реконструкции сократили механические и биологические свойства по сравнению с родной ткань3. С учетом этих соображений ткани инженеры недавно обратились к три трехмерные (3D) подложке производить пользовательские, сложные геометрии, которые являются биологически активных и предназначены для размещения дефект размер и форму, обеспечивая достаточную механические свойства до тех пор, пока биологических ремоделирования является завершения.
В идеале леску 3D-печати будет состоять из полимерной основой, которая может сохранить требуется механическая стабильность родной ткани, пока включены biologics предлагают биохимических подсказки для окружающих клеток, приводит к их миграции, распространение, дифференциация и ткани производства2,5. К сожалению большинство конструкций, содержащие биологические компоненты изготавливаются с гели или полимеров, которые слишком слабы, чтобы выдерживать в vivo силы сталкиваются целевых тканей для авто/аллотрансплантата реконструкции. Другие полимеры, такие как полимолочной кислоты (НОАК), салфетка, 3D печати и структурно звук, но печатаются при температурах или выше 210 ° C – что делает невозможным для биопрепаратов будет совместно печатных во время изготовления. Поликапролактон (PCL) является другой FDA-очищены, салфетка полимер, который может быть 3D печати при низкой температуре (65 ° C), которая становится все более популярным в изготовлении имплантатов пациенту конкретных с сложных морфологии5,6 ,,78,9. Однако большинство bioprinters пневматические технологии делают невозможным печати PCL при более низких температурах, где биологическая деятельность может остаться целым и невредимым. На сегодняшний день, интеграции этих полимеров с auto/аллотрансплантация тканей в романе биоматериала для печати еще предстоит сделать. В отсутствие такого материала вряд ли правда ткани инженерии подход к восстановлению тканей. Таким образом мы стремились объединить НОАК, PCL и decellularized аллотрансплантата матрицы (DM), чтобы использовать преимущества каждого материала для изготовления жизнеспособной конструкции, способные реконструкции комплекса тканей. Этот процесс предоставит первоначальные механическую прочность, необходимо противостоять в vivo силы и термической стабильностью для размещения аддитивного производства в конструкцию, которая стимулирует формирование желаемого ткани.
В последней попыткой решить вышеупомянутые препятствия мы показали, что это возможно для инкапсуляции decellularized хряща внеклеточного матрикса в термически защитный барьер НОАК, который может быть экструдированный в PCL нитей, сохранение способности DM повлиять окружающие клетки узла2. Это вдохновило нас искать клинически эффективные подходы для восстановления тканей. В текущем исследовании мы используем технологию платформы для построения все-в-одном леса, которые включают НОАК, DM и PCL (PLA-DM/PCL).
Наша цель – улучшить эффективность и полезность аллотрансплантантов, используя предлагаемые Роман biofabrication технику, чтобы более точно охарактеризовать родной ткани, в конечном счете использовать их в различных приложениях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Оба decellularized матрицы и 3D печати PCL подмостей независимо было показано, чтобы позволить адгезии и пролиферацию клеток, проверка их использования для остеохондральные ремонт10,,1112. Использование decellularized матрицы в технических подходах к тк…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект частично финансировался грант от детской ортопедической общества Северной Америки (ПОСНА) и национальных институтов здравоохранения предоставляют NIBIB R21EB025378-01 (произвольное биоинженерии исследовательский грант).
Materials
| Sieve machine | Haver & Boecker Tyler | Ro-Tap RX 29-E Pure | |
| Sieve 90 um | Fisherbrand | 170328156 | No. 170 |
| Sieve 53 um | Fisherbrand | 162513588 | No. 270 |
| Sieve 106 um | Fisherbrand | 162018121 | No. 140 |
| Sputter coater | Leica | n/a | |
| Scanning Electron Microscope | Hitachi, USA | n/a | |
| Filabot EX2 | Filabot.com | FB00061 | |
| Filabot Spooler | Filabot.com | FB00073 | |
| CAPA 6506 | Perstorp | 24980-41-4 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Gibco | 10010023 | |
| 6" Fan | Comfort Zone, Amazon | n/a | |
| Ultrasonic Water Bath | Cole Parmer | SK-08895-13 | |
| Dreamer | FlashForge | n/a | |
| Drum Mixer | Custom made | n/a | Similar piece of equipment: https://www.coleparmer.com/i/argos-technologies-flexiroll-digital-tube-roller-shaker-120-vac/0439744?PubID=UX&persist=true&ip= no&gclid=CjwKCAjw- dXaBRAEEiwAbwCi5khGDMz0 dTjsraEsBGfhMEH7ytx LQWGUPNgUJYQ1p3vj_yxkYoI_ ixoC9GwQAvD_BwE |
| Micro Balance | Mettler Toledo, Fisher Scientific | 01-913-851 | |
| Simplify3D | Simplify3D | n/a | |
| SolidWorks | SolidWorks | n/a | |
| Microspheres | Produced in-house, see concurrently submitted JoVE submission | ||
| p-nitrophenyl phosphate, disodium salt, hexahydrate | Millipore | 4876-5GM | |
| Phosphatase, alkaline | Roche Diagnostics GmbH | 10 713 023 001 | |
| Absorbance Reader | Tecan | Sunrise | |
| Tris-HCl Buffer | Sigma-Aldrich | T6455-100ML | |
| Heated shaker | New Brunswick Scientific | Excella E24 |
References
- Hutchmaker, D., Teoh, S., Zein, I., Ng, K. W., Schantz, J. -. T., Leahy, J. C. Design and Fabrication of a 3D Scaffold for Tissue Engineering Bone. Synthetic Bioabsorbable Polymers and Implants. 15 (2), 845-847 (1988).
- Ghosh, P., Gruber, S. M. S., Lin, C. -. Y., Whitlock, P. Microspheres containing decellularized cartilage induce chondrogenesis and remain functional after incorporation within a poly(caprolactone) filament useful for fabricating a 3D scaffold. Biofabrication. , (2018).
- Partington, L., et al. Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds. Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).
- Hutmacher, D. W. Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage. Biomaterials. 21 (24), 2529-2543 (2000).
- Kang, H., Hollister, S. J., La Marca, F., Park, P., Lin, C. -. Y. Porous biodegradable lumbar interbody fusion cage design and fabrication using integrated global-local topology optimization with laser sintering. Journal of biomechanical engineering. 135 (10), 101013-101018 (2013).
- Kang, H., Lin, C. Y., Hollister, S. J. Topology optimization of three dimensional tissue engineering scaffold architectures for prescribed bulk modulus and diffusivity. Structural and Multidisciplinary Optimization. 42 (4), 633-644 (2010).
- Lin, C. -. Y., et al. Functional bone engineering using ex vivo. gene therapy and topology-optimized, biodegradable polymer composite scaffolds. Tissue Engineering. 11 (9-10), 1589-1598 (2005).
- Lin, C. -. Y., Hsiao, C. -. C., Chen, P. -. Q., Hollister, S. J. Interbody Fusion Cage Design Using Integrated Global Layout and Local Microstructure Topology Optimization. Spine. 29 (16), 1747-1754 (2004).
- Zopf, D., Hollister, S., Nelson, M., Ohye, R., Green, G. Bioresorbable Airway Splint Created with a Three-Dimensional Printer. New England Journal of Medicine. 368 (21), 2043-2045 (2013).
- Pati, F., Song, T. H., Rijal, G., Jang, J., Kim, S. W., Cho, D. W. Ornamenting 3D printed scaffolds with cell-laid extracellular matrix for bone tissue regeneration. Biomaterials. 37, 230-241 (2015).
- Zhang, W., et al. The effect of interface microstructure on interfacial shear strength for osteochondral scaffolds based on biomimetic design and 3D printing. Materials Science and Engineering C. 46, 10-15 (2015).
- Williams, J. M., et al. tissue engineering using polycaprolactone scaffolds fabricated via. selective laser sintering. Biomaterials. 26 (23), 4817-4827 (2005).
- Monibi, F. A., Cook, J. L. Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioscaffolds: Emerging Applications in Cartilage and Meniscus Repair. Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2017).
- Wiles, K., Fishman, J., Coppi, P., Birchall, M. The Host Immune Response to Tissue-Engineered Organs: Current Problems and Future Directions. Tissue Engineering Part B: Reviews. 22 (3), (2016).
- Sutherland, A. J., Detamore, M. S. Bioactive Microsphere-Based Scaffolds Containing Decellularized Cartilage. Macromolecular Bioscience. , (2015).
- Whitlock, P. W., Smith, T. L., Poehling, G. G., Shilt, J. S., Van Dyke, M. A naturally derived, cytocompatible, and architecturally optimized scaffold for tendon and ligament regeneration. Biomaterials. , (2007).
- Whitlock, P. W., et al. Effect of cyclic strain on tensile properties of a naturally derived, decellularized tendon scaffold seeded with allogeneic tenocytes and associated messenger RNA expression. Journal of surgical orthopaedic advances. 22 (3), 224-232 (2013).
- Whitlock, P. W., et al. A novel process for optimizing musculoskeletal allograft tissue to improve safety, ultrastructural properties, and cell infiltration. Journal of Bone and Joint Surgery – Series A. 94 (16), 1458-1467 (2012).
- Schultz, G. S., Davidson, J. M., Kirsner, R. S., Herman, I. M. Dynamic Reciprocity in the Wound Microenvironment. Wound Repair Regeneration. 19 (2), 134-148 (2012).
- Benders, K. E. M., van Weeren, P. R., Badylak, S. F., Saris, D. B. F., Dhert, W. J. A., Malda, J. Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration. Trends in Biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).
- Crapo, P., Gilbert, T., Badylak, S. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Guan, Y., et al. Porcine kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration. Materials Science and Engineering C. 56, 451-456 (2015).
- Dean, R. L. Kinetic studies with alkaline phosphatase in the presence and absence of inhibitors and divalent cations. Biochemistry and Molecular Biology Education. 30 (6), 401-407 (2002).
