Novo processo de impressão 3D Decellularized matrizes
Summary
Este protocolo descreve a produção de filamento policaprolactona (PCL) com microesferas de (PLA) de ácido polilático incorporado que contêm matrizes decellularized (DM) para impressão 3D estruturais de engenharia de tecidos construções.
Abstract
Bioprinting 3D visa criar andaimes personalizados que são biologicamente ativos e acomodar o tamanho desejado e geometria. Um backbone de termoplástico pode fornecer estabilidade mecânica semelhante ao tecido nativo enquanto agentes biológicos oferecem pistas composicionais de células progenitoras, levando a sua migração, proliferação e diferenciação para reconstituir os tecidos originais / órgãos1,2. Infelizmente, muitos compatível com impressão 3D, polímeros biorreabsorvível (tais como o ácido polilático, PLA) são impressas em temperaturas de 210 ° C ou superior – temperaturas que são prejudiciais para produtos biológicos. Por outro lado, policaprolactona (PCL), um tipo diferente de poliéster, é uma matriz, material para impressão 3D que tem uma temperatura de impressão mais suave de 65 ° C. Portanto, foi hipotetisado que decellularized da matriz extracelular (DM) contido dentro de uma barreira PLA termicamente protetora poderia ser impresso dentro do filamento PCL e permanecem na sua conformação funcional. Neste trabalho, osteocondrais reparação foi a aplicação para a qual foi testada a hipótese. Como tal, cartilagem porcina foi decellularized e encapsulada em ácido polilático (PLA) microesferas que então foram extrudadas com policaprolactona (PCL) em filamento para produzir construções 3D através de fundidos modelagem de deposição. As construções com ou sem as microesferas (PLA-DM/PCL e PCL(-), respectivamente) foram avaliados para diferenças nas características da superfície.
Introduction
Técnicas de engenharia de tecido atual para aplicações clínicas tais como reconstrução de osso, cartilagem, tendão e ligamento usam autoe aloenxertos para reparar tecidos danificados. Cada uma dessas técnicas é de executada rotineiramente como um “padrão ouro” na prática clínica, pela primeira colheita do tecido do doador do paciente ou uma partida de fetos morta e em seguida, colocando o tecido do doador para o local do defeito2. No entanto, estas estratégias são limitadas pela morbidade local doador escassez local doador para grandes defeitos, risco de infecção e a dificuldade em encontrar enxertos que correspondem a geometria desejada. Além disso, estudos têm mostrado que usado para a reconstrução de aloenxertos reduziram propriedades mecânicas e biológicas, quando comparado com o tecido nativo3. Com estas considerações em mente, os engenheiros de tecido recentemente giraram para três dimensional bioprinting (3D) para produzir personalizadas, complexas geometrias que são biologicamente ativos e projetado para acomodar o tamanho do defeito e forma ao fornecer suficiente Propriedades mecânicas até remodelar biológica é completa.
Idealmente, um andaime 3D-impresso consistiria de um backbone de polímero que pode manter a estabilidade mecânica necessária do tecido nativo enquanto os biologics incorporados oferecem sinais bioquímicos ao redor de células, levando à sua migração, proliferação, diferenciação e produção de tecido2,5. Infelizmente, a maioria das construções que contêm componentes biológicos são feitas com gel ou polímeros que são demasiado fracos para suportar forças na vivo vividas por tecidos alvo para reconstrução de auto/aloenxerto. Outros polímeros tais como o ácido polilático (PLA) são biorreabsorvível, 3D para impressão e estruturalmente som, mas são impressos em temperaturas igual ou superior a 210 ° C – tornando-se impossível para ser impresso co durante a fabricação de produtos biológicos. Policaprolactona (PCL) é outro FDA-desmarcada, biorreabsorvível polímero que pode ser 3D imprimido em uma temperatura mais baixa (65 ° C), que se tornou cada vez mais popular na fabricação de implantes de paciente específico com morfologias complexo5,6 ,7,8,9. No entanto, a maioria dos bioprinters usando tecnologia pneumática impossibilitam a impressão PCL a temperaturas mais baixas, onde atividades biológicas podem ilesos. Até à data, a integração destes polímeros com auto/aloenxertos em um romance printable biomaterial ainda tem de ser realizado. Na ausência de um material, uma abordagem de engenharia de tecidos verdadeiro para reconstrução de tecidos é improvável. Portanto, temos procurado combinar PLA, PCL e decellularized matrizes aloenxerto (DM) para utilizar as vantagens de cada material para fabricar uma construção viável capaz de reconstruir tecidos complexos. Este processo seria fornecer resistência mecânica inicial necessária para resistir a forças na vivo e a estabilidade térmica para acomodar fabricação aditiva em uma construção que induz a formação do tecido desejado.
Em uma recente tentativa de abordar os obstáculos acima mencionados, nós mostramos que é viável para encapsular a matriz extracelular da cartilagem decellularized dentro de uma barreira PLA termicamente protetora que pode ser extrudada dentro de filamentos PCL, mantendo a capacidade de DM para influenciar as células circundantes de host2. Isso inspirou-na procurar abordagens clinicamente eficazes para reconstrução de tecidos. No estudo atual, nós utilizamos a tecnologia de plataforma para construir andaimes de tudo-em-um que incluem PLA, DM e PCL (PLA-DM/PCL).
Nosso objetivo é melhorar a eficácia e a utilidade dos enxertos usando a técnica de biofabrication romance proposto com mais precisão recapitular tecido nativo, para, finalmente, usá-los em várias aplicações.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ambos decellularized matrizes e 3D impresso PCL andaimes independentemente foram mostrados para permitir a adesão e proliferação de células, validando seu uso para osteocondrais reparar10,11,12. O uso da matriz decellularized em abordagens de engenharia para reparação tecidual tem sido um assunto de muito interesse e sucesso no recente passado2,3,<sup cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este projeto foi parcialmente financiado por um subsídio do pediátrico ortopédico sociedade da América do Norte (POSNA) e o National Institutes of Health conceder NIBIB R21EB025378-01 (bolsa de pesquisa exploratória bioengenharia).
Materials
| Sieve machine | Haver & Boecker Tyler | Ro-Tap RX 29-E Pure | |
| Sieve 90 um | Fisherbrand | 170328156 | No. 170 |
| Sieve 53 um | Fisherbrand | 162513588 | No. 270 |
| Sieve 106 um | Fisherbrand | 162018121 | No. 140 |
| Sputter coater | Leica | n/a | |
| Scanning Electron Microscope | Hitachi, USA | n/a | |
| Filabot EX2 | Filabot.com | FB00061 | |
| Filabot Spooler | Filabot.com | FB00073 | |
| CAPA 6506 | Perstorp | 24980-41-4 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Gibco | 10010023 | |
| 6" Fan | Comfort Zone, Amazon | n/a | |
| Ultrasonic Water Bath | Cole Parmer | SK-08895-13 | |
| Dreamer | FlashForge | n/a | |
| Drum Mixer | Custom made | n/a | Similar piece of equipment: https://www.coleparmer.com/i/argos-technologies-flexiroll-digital-tube-roller-shaker-120-vac/0439744?PubID=UX&persist=true&ip= no&gclid=CjwKCAjw- dXaBRAEEiwAbwCi5khGDMz0 dTjsraEsBGfhMEH7ytx LQWGUPNgUJYQ1p3vj_yxkYoI_ ixoC9GwQAvD_BwE |
| Micro Balance | Mettler Toledo, Fisher Scientific | 01-913-851 | |
| Simplify3D | Simplify3D | n/a | |
| SolidWorks | SolidWorks | n/a | |
| Microspheres | Produced in-house, see concurrently submitted JoVE submission | ||
| p-nitrophenyl phosphate, disodium salt, hexahydrate | Millipore | 4876-5GM | |
| Phosphatase, alkaline | Roche Diagnostics GmbH | 10 713 023 001 | |
| Absorbance Reader | Tecan | Sunrise | |
| Tris-HCl Buffer | Sigma-Aldrich | T6455-100ML | |
| Heated shaker | New Brunswick Scientific | Excella E24 |
References
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