تحليل البروتين الاستقطاب بلعم البشرية تحت بيئة منخفضة الأكسجين
Summary
نقدم بروتوكول للحصول على توقيعات البروتين الضامة البشرية وتطبيق هذا على تحديد أثر بيئة منخفضة الأكسجين في الاستقطاب بلعم.
Abstract
الضامة هي الخلايا المناعية الفطرية تشارك في عدد من الوظائف الفسيولوجية التي تتراوح من الردود على مسببات الأمراض المعدية إلى التوازن الأنسجة. وظائف مختلفة من هذه الخلايا تتصل بدولهم التنشيط، الذي يسمى أيضا الاستقطاب. الوصف الجزيئي الدقيق لهذه الاستقطابات المختلفة أولويات في مجال البيولوجيا بلعم. من المسلم به حاليا أن اتباع نهج متعدد الأبعاد ضروري لوصف كيفية التحكم في استقطاب الإشارات البيئية. وفي هذا التقرير، يصف لنا بروتوكول مصمم للحصول على توقيع البروتين استقطابات مختلفة في الضامة البشرية. ويستند هذا البروتوكول إجراء تقييم كمي للتعبير البروتين بلعم الحصول عليها من مجزأ بهلام ومحتوى تحلل الخلوية Lys ج/التربسين-يهضم خالية من التسمية. نحن نقدم أيضا بروتوكول استناداً إلى الهضم بالحل و isoelectric تركز تجزئة لاستخدامه كبديل لذلك. نظراً لأن تركيز الأكسجين معلمة بيئية ذات صلة في الأنسجة، يمكننا استخدام هذا البروتوكول لاستكشاف تركيبة الغلاف الجوي كيف أو بيئة منخفضة أكسجين يؤثر على تصنيف بلعم الاستقطاب.
Introduction
الضامة هي الخلايا المناعية الفطرية تشارك في عدد من الوظائف الفسيولوجية التي تتراوح من الردود على مسببات الأمراض المعدية إلى التوازن الأنسجة، بما في ذلك إزالة الخلايا أبوبتوتيك وتجديد المصفوفة خارج الخلية1. تتميز هذه الخلايا اللدونة المظهرية قوية2 أن يترجم إلى إمكانية تنشيط العديد من دول، التي تسمى أيضا الاستقطابات. الوصف الجزيئي الدقيق لهذه الاستقطابات المختلفة أولويات في مجال علم الأحياء بلعم3. اقترح تصنيف هذه الاستقطابات استخدام ما يسمى الانقسام M1/M2، الذي يمثل M1 برو التحريضية و M2 يمثل الضامة للالتهابات. يناسب هذا النموذج جيدا في مختلف الحالات المرضية مثل الالتهابات الحادة والحساسية والسمنة4. ومع ذلك، في الأنسجة الملتهبة المزمن والسرطان، وقد ثبت أن هذا التصنيف غير قادر على فهم مرجع المظهرية الواسعة التي الضامة الموجودة في بعض البيئات الخلوية5،6، 7-توافق الآراء الحالي أن بلعم الاستقطاب أفضل وصف باستخدام نموذج متعدد الأبعاد لدمج إشارات محددة ميكرونفيرونمينتال8. وقد أكد هذا الاستنتاج من خلال تحليل ترانسكريبتوميك الضامة البشرية تبين أن طراز M1/M2 غير فعال في وصف الاستقطابات حصل على9.
قدمت الدراسة يهدف إلى توفير بروتوكول للحصول على توقيعات البروتين من استقطابات مختلفة في الضامة البشرية. ونحن تصف كيفية التفريق الضامة البشرية في بيئات لمختلف مستويات الأوكسجين والحصول على الببتيدات من البروتين بلعم كاملة القيام بإجراء تقييم كمي خالية من التسمية. ويسمح هذا التحديد الكمي مقارنة مستويات التعبير من البروتينات المختلفة. كما كشفت الأبحاث حول الخلايا الجذعية أهمية الأوكسجين معلمة رئيسية بيئية10، نحن نسعى إلى فهم كيف يمكن أن تؤثر هذه المعلمة الأنسجة بلعم الاستقطاب في البشر. الضغط الجزئي للأكسجين قد وجد أن تتراوح من 3 إلى 20% (من مجموع الضغط الجوي) في جسم الإنسان، حيث يقابل 20% تقريبا لما يستخدم عادة في حاضنة ثقافة خلية (القيمة الصحيحة هي حوالي 18.6 في المائة مع مراعاة وجود الماء في الاعتبار).
وقد أظهرت الأعمال السابقة أن السنخية تختلف عن الضامة فراغي من الوظيفية والمورفولوجية نقطة المشاهدات11 وأن هذه الاختلافات على الأرجح جزئيا نظراً لمستويات مختلفة من الأكسجين التي هي عرضه12. وعلاوة على ذلك، تظهر المشتقة من نخاع العظم الضامة زيادة قدرة على فاجوسيتيزي البكتيريا عند تعرضها ل بيئة منخفضة أكسجين12. تم العثور على تأثير معاكس الضامة البشرية المتباينة THP113، ولكن هذه النتائج تدعم الفكرة القائلة بأن الأكسجين منظم للبيولوجيا بلعم وأن من الضروري توضيح هذا الدور على المستوى الجزيئي في الضامة البشرية. وفي دراسة سابقة، المطبقة لدينا نهج البروتيوميات لمعالجة هذه القضايا. عن طريق قياس مستويات التعبير لآلاف بروتينات في نفس الوقت، سلطت الضوء على تأثير الأكسجين على الاستقطاب، وقدمت قائمة بالمؤشرات الجزيئية الجديدة. تمكنا أيضا من ربط هذه النتائج ببعض وظائف الضامة. جدير بالذكر أن وجدنا أن معدل البلعمه لخلايا apoptotic قد زيدت في الضامة IL4/IL13-الاستقطاب، التي ترتبط ب upregulation ALOX15 كما يتبين من تحليل البروتين14. في هذه الدراسة، ونحن تصف كيفية إجراء هذا تحليل.
Protocol
Representative Results
Discussion
لأن البروتيوميات أداة قوية لدراسة التعبير عن البروتينات المختلفة من خلية كاملة أو مقصورات سوبسيلولار، الأمثل للبروتوكول تحلل الخلية وهضم البروتينات قد عولجت بعدد من الدراسات. وهناك ثلاث فئات رئيسية من الأساليب، التي تشمل في جل الهضم (هضم البروتينات في مصفوفة جل polyacrylamide)17، ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
صباحا هو الممول من قبل “برنامج زعيم مجموعة الشباب” (ATIP/افينير Inserm-يزار)، بلوس أنجليس الرابطة الوطنية le مكافحة السرطان ولوس أنجليس “مؤسسة قوس” من أجل la بحوث sur le السرطان. ونحن نشكر مارييت ماتوندو من “قياس الطيف الكتلي” لمنهاج علم الأحياء (أوتيتشس مسبيو، ومعهد باستور، باريس). ونحن نشكر لورين أندرسون للقراءة لها من المخطوطة.
Materials
| Hypoxia Working Station | Oxford Optronix | Hypoxylab | |
| C6 Flow cytometer | BD | Accuri C6 | |
| Urea | Agilent Technologies | 5188-6435 | |
| Formic acid (FA) | ARISTAR | 450122M | |
| R-250 Coomassie blue | Biorad | 1,610,436 | |
| Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS) | Calbiochem | 437627 | |
| 2D clean-up kit | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| RPMI 1640 medium, glutamax supplement | Gibco | 61870044 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X | Gibco | 11140-035 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X | Gibco | 14190-094 | |
| Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column | Harvard Apparatus | 74-4601 | |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| NuPAGE Bis-Tris 4-12% | Life Technologies SAS | NP0321 BOX | |
| CD14 Microbeads human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| MACS separation column LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) | Miltenyi Biotec | 130-096-485 | |
| Interleukin 4 (IL4) | Miltenyi Biotec | 130-093-917 | |
| Interleukin 13 (IL13) | Miltenyi Biotec | 130-112-410 | |
| Interferon gamma (INFγ) | Miltenyi Biotec | 130-096-482 | |
| CD14-FITC (clone TÜK4) | Miltenyi Biotec | 130-080-701 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Pierce | 28904 | |
| Trypsin/Lys-C Mix | PROMEGA | V5073 | |
| Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Density Gradient Solution (Histopaque 1077) | Sigma Aldrich | 10771-100ML | |
| Accumax | Sigma Aldrich | A7089-100ML | |
| Human Serum from human male AB plasma (SAB) | Sigma Aldrich | H4522-100ML | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30% | Sigma Aldrich | A9576-50ML | |
| Trisma-base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | 49767 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | 114405 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20% | Sigma Aldrich | 5030 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 9830 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34888 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Iodoacetamide | Sigma Aldrich | 57670 | |
| Thiourea | Sigma Aldrich | T8656 | |
| CHAPS | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Micro BCA Assay Kit | ThermoFisher | 23235 | |
| 5 mL sterile plastic pipette | VWR | 612-1685 | |
| Thermomixer C Eppendorf | VWR | 460-0223 | |
| Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg | Waters | WAT036820 |
References
- Okabe, Y., Medzhitov, R. Tissue biology perspective on macrophages. Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).
- Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).
- Murray, P. J. Macrophage Polarization. Annual Review of Physiology. 79, 541-566 (2017).
- Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. Macrophage polarization in metabolic disorders: functions and regulation. Current Opinion in Lipidology. 22 (5), 365-372 (2011).
- Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
- Xue, J., et al. Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation. Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).
- Csete, M. Oxygen in the cultivation of stem cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 1-8 (2005).
- Johansson, A., et al. Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 16 (5), 582-588 (1997).
- Pfau, J. C., Schneider, J. C., Archer, A. J., Sentissi, J., Leyva, F. J., Cramton, J. Environmental oxygen tension affects phenotype in cultured bone marrow-derived macrophages. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (2), L354-L362 (2004).
- Grodzki, A. C. G., Giulivi, C., Lein, P. J. Oxygen tension modulates differentiation and primary macrophage functions in the human monocytic THP-1 cell line. PLoS One. 8 (1), e54926 (2013).
- Court, M., Petre, G., Atifi, M. E., Millet, A. Proteomic Signature Reveals Modulation of Human Macrophage Polarization and Functions Under Differing Environmental Oxygen Conditions. Molecular & Cellular Proteomics. 16 (12), 2153-2168 (2017).
- Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Cox, J., Neuhauser, N., Michalski, A., Scheltema, R. A., Olsen, J. V., Mann, M. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Court, M., et al. Toward a standardized urine proteome analysis methodology. Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).
- Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
- Liebler, D. C., Ham, A. -. J. L. Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics. Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).
- Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis. Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).
- Park, J., et al. Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics. Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).
- Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of oxygen and culture media on plating efficiency of some mammalian tissue cells. Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
- Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).
- Lengner, C. J., et al. Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations. Cell. 141 (5), 872-883 (2010).
- Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology. Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).
