Proteoom analyse van menselijke Macrophage polarisatie onder een lage zuurstof-omgeving
Summary
Presenteren we een protocol voor het verkrijgen van proteomic handtekeningen van menselijke macrofagen en dit toepassen op de bepaling van de invloed van een lage zuurstof milieu op macrophage polarisatie.
Abstract
Macrofagen zijn ingeboren immune cellen die betrokken zijn bij een aantal fysiologische functies variërend van reacties op infectieziekten pathogenen tot weefsel homeostase. De verschillende functies van deze cellen zijn gerelateerd aan hun activatie-Staten, die heet ook polarisatie. De exacte moleculaire beschrijving van deze verschillende polarisaties is een prioriteit op het gebied van macrofaag biologie. Momenteel wordt erkend dat een multidimensionale aanpak is noodzakelijk om te beschrijven hoe polarisatie wordt gecontroleerd door Milieusignalen. In dit verslag beschrijven we een protocol ontworpen voor de proteomic ondertekening van verschillende polarisaties in menselijke macrofagen. Dit protocol is gebaseerd op een label-vrije kwantificering van macrofaag eiwituitdrukking verkregen in-gel gespreide en Lys C/trypsine-verteerd cellulaire lysis inhoud. We bieden ook een protocol op basis van-oplossing spijsvertering en elektrisch gericht fractionering als alternatief te gebruiken. Omdat zuurstofconcentratie een relevante milieu-parameter in de weefsels is, we gebruiken dit protocol om te verkennen hoe atmosferische samenstelling of een lage zuurstof-omgeving is van invloed op de indeling van de macrofaag polarisatie.
Introduction
Macrofagen zijn ingeboren immune cellen die betrokken zijn bij een aantal fysiologische functies variërend van reacties op infectieziekten pathogenen tot weefsel homeostase, met inbegrip van de verwijdering van apoptotic cellen en reorganisatie van de extracellulaire matrix1. Deze cellen worden gekenmerkt door een sterke fenotypische plasticiteit2 dat vertaalt zich in een veel mogelijke activering Staten, ook wel genoemd polarisaties. De exacte moleculaire beschrijving van deze verschillende polarisaties is een prioriteit op het gebied van macrofaag biologie3. Er is voorgesteld om te classificeren deze polarisaties met behulp van de zogenaamde M1/M2-tweedeling, waarin M1 staat voor pro-inflammatoire en M2 voor anti-inflammatoire macrofagen. Dit model past goed in diverse pathologische situaties zoals acute infecties, allergie en obesitas4. Echter in chronisch ontstoken weefsels en kanker, is gebleken dat deze indeling is niet in staat om te begrijpen de brede fenotypische repertoire dat macrofagen aanwezig in bepaalde cellulaire omgevingen5,6,, 7. de huidige consensus is dat de macrofaag polarisatie beter wordt beschreven met behulp van een multidimensionale model te integreren van specifieke microenvironmental signalen8. Deze conclusie werd bevestigd door transcriptomic analyse van menselijke macrofagen waaruit blijkt dat het model van de M1/M2 in het beschrijven van de verkregen polarisaties9inefficiënt.
De studie gepresenteerd is gericht op het bieden van een protocol voor proteomic handtekeningen voor verschillende polarisaties in menselijke macrofagen. We beschrijven hoe onderscheiden van menselijke macrofagen in omgevingen van verschillende zuurstofniveaus en peptiden te verkrijgen van de hele macrofaag Proteoom voor het uitvoeren van een label-vrije kwantificering. Deze kwantificering kan de vergelijking van de expressie niveaus van verschillende eiwitten. Als het onderzoek aan stamcellen blijkt het belang van zuurstof als een milieu belangrijke parameter10, proberen wij te begrijpen hoe deze parameter weefsel macrofaag polarisatie in mensen kan beïnvloeden. De gedeeltelijke druk van zuurstof is gebleken dat bereik van 3 tot 20% (van totale luchtdruk) in het menselijk lichaam, waarbij 20% overeenkomt met ongeveer wat vaak in een cel cultuur incubator gebruikt wordt (de exacte waarde is ongeveer 18,6% terwijl het nemen van de aanwezigheid van water rekening).
Vorige werk heeft aangetoond dat alveolaire verschillen van interstitiële macrofagen van functionele en morfologische punt van uitzicht11 en dat deze verschillen zijn waarschijnlijk gedeeltelijk te wijten aan de verschillende zuurstofniveaus waaraan zij blootgesteld12 zijn. Beenmerg-afgeleide macrofagen Toon bovendien een verhoogde kunnen bacteriën bij blootstelling aan een lage zuurstof milieu12phagocytize. Het tegenovergestelde effect is gebleken voor menselijke macrofagen THP1-gesplitste13, maar deze resultaten ondersteunen het idee dat zuurstof een regulator van macrofaag biologie is en dat het noodzakelijk is deze rol op moleculair niveau in menselijke macrofagen te verduidelijken. In een eerdere studie, hebben wij toegepast een proteomics benadering van deze kwesties. Door gelijktijdig bij het meten van expressie niveaus voor duizenden eiwitten, we gewezen op het effect van zuurstof op polarisatie en verstrekt een lijst van nieuwe moleculaire markers. We hebben ook kunnen betrekking hebben op deze bevindingen tot enkele functies van de macrofagen. Met name, vonden we dat het percentage fagocytose van apoptotic cellen was verhoogd in IL4/IL13-gepolariseerde macrofagen, die was gekoppeld aan de opregulatie van ALOX15 zoals geopenbaard door de Proteoom analyse14. In de huidige studie beschrijven we het uitvoeren van een dergelijke analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Omdat proteomics een krachtig hulpmiddel om te bestuderen van de expressie van verschillende eiwitten uit een hele cel of subcellular compartimenten is, is optimalisatie van het protocol van de lysis van de cel en de vertering van eiwitten aangepakt door een aantal studies. Er zijn drie belangrijke klassen van methoden, waaronder in-gel spijsvertering (vertering van eiwitten in polyacrylamidegel matrix)17, spijsvertering in oplossing18 en filter-aided monster voorbereiding<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AM wordt gefinancierd door de jonge groep Leader programma ATIP/Avenir Inserm-CNRS, door la Ligue Nationale contre le Cancer en la ARC van de Fondation pour la recherche sur le Cancer. Wij danken Mariette Matondo van de Spectrometrie van de massa voor biologie-platform (UTECHS MSBIO, Pasteur Instituut, Parijs). Wij danken Lauren Anderson voor haar lezing van het manuscript.
Materials
| Hypoxia Working Station | Oxford Optronix | Hypoxylab | |
| C6 Flow cytometer | BD | Accuri C6 | |
| Urea | Agilent Technologies | 5188-6435 | |
| Formic acid (FA) | ARISTAR | 450122M | |
| R-250 Coomassie blue | Biorad | 1,610,436 | |
| Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS) | Calbiochem | 437627 | |
| 2D clean-up kit | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| RPMI 1640 medium, glutamax supplement | Gibco | 61870044 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X | Gibco | 11140-035 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X | Gibco | 14190-094 | |
| Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column | Harvard Apparatus | 74-4601 | |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| NuPAGE Bis-Tris 4-12% | Life Technologies SAS | NP0321 BOX | |
| CD14 Microbeads human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| MACS separation column LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) | Miltenyi Biotec | 130-096-485 | |
| Interleukin 4 (IL4) | Miltenyi Biotec | 130-093-917 | |
| Interleukin 13 (IL13) | Miltenyi Biotec | 130-112-410 | |
| Interferon gamma (INFγ) | Miltenyi Biotec | 130-096-482 | |
| CD14-FITC (clone TÜK4) | Miltenyi Biotec | 130-080-701 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Pierce | 28904 | |
| Trypsin/Lys-C Mix | PROMEGA | V5073 | |
| Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Density Gradient Solution (Histopaque 1077) | Sigma Aldrich | 10771-100ML | |
| Accumax | Sigma Aldrich | A7089-100ML | |
| Human Serum from human male AB plasma (SAB) | Sigma Aldrich | H4522-100ML | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30% | Sigma Aldrich | A9576-50ML | |
| Trisma-base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | 49767 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | 114405 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20% | Sigma Aldrich | 5030 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 9830 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34888 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Iodoacetamide | Sigma Aldrich | 57670 | |
| Thiourea | Sigma Aldrich | T8656 | |
| CHAPS | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Micro BCA Assay Kit | ThermoFisher | 23235 | |
| 5 mL sterile plastic pipette | VWR | 612-1685 | |
| Thermomixer C Eppendorf | VWR | 460-0223 | |
| Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg | Waters | WAT036820 |
References
- Okabe, Y., Medzhitov, R. Tissue biology perspective on macrophages. Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).
- Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).
- Murray, P. J. Macrophage Polarization. Annual Review of Physiology. 79, 541-566 (2017).
- Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. Macrophage polarization in metabolic disorders: functions and regulation. Current Opinion in Lipidology. 22 (5), 365-372 (2011).
- Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
- Xue, J., et al. Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation. Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).
- Csete, M. Oxygen in the cultivation of stem cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 1-8 (2005).
- Johansson, A., et al. Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 16 (5), 582-588 (1997).
- Pfau, J. C., Schneider, J. C., Archer, A. J., Sentissi, J., Leyva, F. J., Cramton, J. Environmental oxygen tension affects phenotype in cultured bone marrow-derived macrophages. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (2), L354-L362 (2004).
- Grodzki, A. C. G., Giulivi, C., Lein, P. J. Oxygen tension modulates differentiation and primary macrophage functions in the human monocytic THP-1 cell line. PLoS One. 8 (1), e54926 (2013).
- Court, M., Petre, G., Atifi, M. E., Millet, A. Proteomic Signature Reveals Modulation of Human Macrophage Polarization and Functions Under Differing Environmental Oxygen Conditions. Molecular & Cellular Proteomics. 16 (12), 2153-2168 (2017).
- Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Cox, J., Neuhauser, N., Michalski, A., Scheltema, R. A., Olsen, J. V., Mann, M. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Court, M., et al. Toward a standardized urine proteome analysis methodology. Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).
- Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
- Liebler, D. C., Ham, A. -. J. L. Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics. Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).
- Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis. Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).
- Park, J., et al. Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics. Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).
- Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of oxygen and culture media on plating efficiency of some mammalian tissue cells. Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
- Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).
- Lengner, C. J., et al. Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations. Cell. 141 (5), 872-883 (2010).
- Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology. Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).
