एक कम ऑक्सीजन पर्यावरण के तहत मानव मैक्रोफेज ध्रुवीकरण का Proteomic विश्लेषण
Summary
हम मानव मैक्रोफेज के proteomic हस्ताक्षर प्राप्त करने और मैक्रोफेज ध्रुवीकरण पर एक कम ऑक्सीजन पर्यावरण के प्रभाव के निर्धारण के लिए इस लागू करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं ।
Abstract
मैक्रोफेज जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं को ऊतक homeostasis के लिए संक्रामक रोगजनकों प्रतिक्रियाओं से लेकर शारीरिक कार्यों की एक संख्या में शामिल हैं । इन कोशिकाओं के विभिंन कार्यों उनके सक्रियण राज्यों से संबंधित हैं, जो भी ध्रुवीकरण कहा जाता है । इन विभिन्न ध्रुवीकरण का सटीक आणविक वर्णन मैक्रोफेज जीव विज्ञान के क्षेत्र में एक प्राथमिकता है । यह वर्तमान में स्वीकार किया है कि एक बहुआयामी दृष्टिकोण का वर्णन कैसे ध्रुवीकरण पर्यावरण संकेतों से नियंत्रित है आवश्यक है । इस रिपोर्ट में, हम मानव मैक्रोफेज में विभिन्न ध्रुवीकरण के proteomic हस्ताक्षर प्राप्त करने के लिए डिज़ाइन किए गए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं । इस प्रोटोकॉल में जेल fractionated और Lys सी/trypsin-डाइजेस्ट सेलुलर lysis सामग्री से प्राप्त मैक्रोफेज प्रोटीन अभिव्यक्ति की एक लेबल मुक्त ठहराव पर आधारित है । हम भी एक विकल्प के रूप में उपयोग करने के लिए में समाधान पाचन और isoelectric ध्यान केंद्रित भिन्नीकरण पर आधारित एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । क्योंकि ऑक्सीजन एकाग्रता ऊतकों में एक प्रासंगिक पर्यावरण पैरामीटर है, हम इस प्रोटोकॉल का उपयोग कैसे वायुमंडलीय संरचना या एक कम ऑक्सीजन पर्यावरण मैक्रोफेज ध्रुवीकरण के वर्गीकरण को प्रभावित करता है का पता लगाने के लिए ।
Introduction
मैक्रोफेज जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं को संक्रामक रोगजनकों के लिए प्रतिक्रियाओं से ऊतक homeostasis को लेकर शारीरिक कार्यों की एक संख्या में शामिल हैं, अपोप्तोटिक कोशिकाओं को हटाने और extracellular मैट्रिक्स1के पुननिर्माण सहित । इन कोशिकाओं को एक मजबूत phenotypic प्लास्टिक2 कि एक बहुत संभव सक्रियण राज्यों, जो भी ध्रुवीकरण कहा जाता है में तब्दील द्वारा विशेषता है । इन विभिंन ध्रुवीकरण का सटीक आणविक वर्णन मैक्रोफेज जीव विज्ञान के क्षेत्र में एक प्राथमिकता है3। यह तथाकथित m1/m2 विरोधाभास का उपयोग कर इन ध्रुवीकरण को वर्गीकृत करने का प्रस्ताव किया गया है, जिसमें m1 समर्थक भड़काऊ का प्रतिनिधित्व करता है और m2 विरोधी भड़काऊ मैक्रोफेज का प्रतिनिधित्व करता है । यह मॉडल तीव्र संक्रमण, एलर्जी, और मोटापा4जैसे विभिन्न रोग स्थितियों में अच्छी तरह से फिट बैठता है । हालांकि, जीर्ण सूजन के ऊतकों और कैंसर में, यह प्रदर्शित किया गया है कि इस वर्गीकरण के लिए व्यापक phenotypic प्रदर्शनों कि मैक्रोफेज कुछ सेलुलर वातावरण में मौजूद5,6समझ में असमर्थ है, 7. वर्तमान आम सहमति है कि मैक्रोफेज ध्रुवीकरण बेहतर एक बहुआयामी मॉडल का उपयोग करने के लिए एकीकृत विशिष्ट microenvironmental संकेतों8वर्णित है । इस निष्कर्ष में मानव मैक्रोफेज के transcriptomic विश्लेषण के माध्यम से पुष्टि की गई है कि एम1/M2 मॉडल प्राप्त ध्रुवीकरण9का वर्णन करने में असक्षम है ।
प्रस्तुत अध्ययन में मानव मैक्रोफेज में विभिन्न ध्रुवीकरण के proteomic हस्ताक्षर प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करना है । हम विभिंन ऑक्सीजन के स्तर के वातावरण में मानव मैक्रोफेज अंतर करने के लिए और एक लेबल मुक्त ठहराव प्रदर्शन करने के लिए पूरे मैक्रोफेज proteome से पेप्टाइड्स प्राप्त करने के लिए कैसे का वर्णन । यह ठहराव विभिन्न प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना की अनुमति देता है । के रूप में स्टेम सेल पर अनुसंधान एक पर्यावरणीय कुंजी पैरामीटर10के रूप में ऑक्सीजन के महत्व से पता चला है, हम समझ कैसे इस ऊतक पैरामीटर मानव में मैक्रोफेज ध्रुवीकरण को प्रभावित कर सकते है की तलाश । ऑक्सीजन का आंशिक दबाव मानव शरीर में 3 से 20% (कुल वायुमंडलीय दबाव) की सीमा को पाया गया है, जहां 20% मोटे तौर पर क्या आमतौर पर एक सेल संस्कृति मशीन में इस्तेमाल किया जाता है (सटीक मूल्य के आसपास है १८.६% जबकि पानी की उपस्थिति लेने खाते में) ।
पिछले काम से पता चला है कि वायुकोशीय मध्य मैक्रोफेज से कार्यात्मक और दृष्टिकोण11 के रूपात्मक बिंदु से अलग है और यह कि इन मतभेदों को शायद आंशिक रूप से विभिंन ऑक्सीजन का स्तर है जो वे12उजागर कर रहे है के कारण हैं । इसके अलावा, अस्थि मज्जा-व्युत्पंन मैक्रोफेज बैक्टीरिया phagocytize करने के लिए एक वृद्धि की क्षमता दिखाने के लिए जब एक कम ऑक्सीजन पर्यावरण12से अवगत कराया । THP1-विभेदित मानव मैक्रोफेज१३के लिए विपरीत प्रभाव पाया गया है, लेकिन ये परिणाम इस विचार का समर्थन करते हैं कि ऑक्सीजन मैक्रोफेज बायोलॉजी का एक नियामक है और यह मानव मैक्रोफेज में आणविक स्तर पर इस भूमिका को स्पष्ट करने के लिए आवश्यक है. पिछले एक अध्ययन में, हम इन मुद्दों को हल करने के लिए एक प्रोटियोमिक् दृष्टिकोण लागू किया है । एक साथ प्रोटीन के हजारों के लिए अभिव्यक्ति के स्तर को मापने के द्वारा, हम ध्रुवीकरण पर ऑक्सीजन के प्रभाव पर प्रकाश डाला और नए आणविक मार्करों की एक सूची प्रदान की । हम भी कुछ मैक्रोफेज कार्यों के लिए इन निष्कर्षों से संबंधित करने में सक्षम थे । विशेष रूप से, हमने पाया है कि अपोप्तोटिक कोशिकाओं के phagocytosis की दर IL4 में वृद्धि हुई थी/IL13-ध्रुवीकरण मैक्रोफेज, जो ALOX15 के विनियमन से जुड़ा हुआ था के रूप में proteomic विश्लेषण14द्वारा प्रगट । वर्तमान अध्ययन में, हम इस तरह के एक विश्लेषण करने के लिए कैसे का वर्णन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
क्योंकि प्रोटियोमिक् एक पूरे सेल या सेलुलर डिब्बों से अलग प्रोटीन की अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, कोशिका lysis प्रोटोकॉल और प्रोटीन के पाचन का अनुकूलन अध्ययन के एक नंबर से संबो?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AM युवा समूह के नेता कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित है (ातिप/Avenir Inserm-CNRS), ला Ligue राष्ट्रीयकृत contre le कैंसर और ला शौकीन चाप डालो ला सभ्य सुर le कैंसर द्वारा । हम मास स्पेक्ट्रोमेट्री फॉर बायोलॉजी प्लेटफार्म (UTECHS MSBIO, पाश्चर इंस्टीट्यूट, पेरिस) से Mariette Matondo का धन्यवाद करते हैं । हम उसे पांडुलिपि के पढ़ने के लिए लॉरेन एंडरसन धंयवाद ।
Materials
| Hypoxia Working Station | Oxford Optronix | Hypoxylab | |
| C6 Flow cytometer | BD | Accuri C6 | |
| Urea | Agilent Technologies | 5188-6435 | |
| Formic acid (FA) | ARISTAR | 450122M | |
| R-250 Coomassie blue | Biorad | 1,610,436 | |
| Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS) | Calbiochem | 437627 | |
| 2D clean-up kit | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| RPMI 1640 medium, glutamax supplement | Gibco | 61870044 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X | Gibco | 11140-035 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X | Gibco | 14190-094 | |
| Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column | Harvard Apparatus | 74-4601 | |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| NuPAGE Bis-Tris 4-12% | Life Technologies SAS | NP0321 BOX | |
| CD14 Microbeads human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| MACS separation column LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) | Miltenyi Biotec | 130-096-485 | |
| Interleukin 4 (IL4) | Miltenyi Biotec | 130-093-917 | |
| Interleukin 13 (IL13) | Miltenyi Biotec | 130-112-410 | |
| Interferon gamma (INFγ) | Miltenyi Biotec | 130-096-482 | |
| CD14-FITC (clone TÜK4) | Miltenyi Biotec | 130-080-701 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Pierce | 28904 | |
| Trypsin/Lys-C Mix | PROMEGA | V5073 | |
| Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Density Gradient Solution (Histopaque 1077) | Sigma Aldrich | 10771-100ML | |
| Accumax | Sigma Aldrich | A7089-100ML | |
| Human Serum from human male AB plasma (SAB) | Sigma Aldrich | H4522-100ML | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30% | Sigma Aldrich | A9576-50ML | |
| Trisma-base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | 49767 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | 114405 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20% | Sigma Aldrich | 5030 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 9830 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34888 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Iodoacetamide | Sigma Aldrich | 57670 | |
| Thiourea | Sigma Aldrich | T8656 | |
| CHAPS | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Micro BCA Assay Kit | ThermoFisher | 23235 | |
| 5 mL sterile plastic pipette | VWR | 612-1685 | |
| Thermomixer C Eppendorf | VWR | 460-0223 | |
| Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg | Waters | WAT036820 |
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