Analisi proteomica di polarizzazione di macrofago umano in un ambiente a basso tenore di ossigeno
Summary
Vi presentiamo un protocollo per ottenere le firme di proteomica dei macrofagi umani e da applicare per determinare l’impatto di un ambiente di ossigeno basso sulla polarizzazione del macrofago.
Abstract
I macrofagi sono cellule dell’immunità innata coinvolti in una serie di funzioni fisiologiche che vanno dalle risposte agli agenti patogeni infettivi all’omeostasi del tessuto. Le varie funzioni di queste cellule sono legate alla loro Stati di attivazione, che è anche chiamato polarizzazione. La precisa descrizione molecolare di queste varie polarizzazioni è una priorità nel campo della biologia del macrofago. È attualmente riconosciuto che un approccio multidimensionale è necessario descrivere come polarizzazione è controllata da segnali ambientali. In questo rapporto, descriviamo un protocollo progettato per ottenere la firma di proteomica di varie polarizzazioni in macrofagi umani. Questo protocollo è basato su una quantificazione dell’espressione della proteina del macrofago ottenuto da Lys C/tripsina-digerito lisi cellulare contenuti e frazionati in gel privo di etichetta. Forniamo anche un protocollo basato sulla soluzione in digestione e frazionamento da utilizzare come alternativa di messa a fuoco isoelettrico. Perché la concentrazione di ossigeno è un parametro ambientale rilevante nei tessuti, utilizziamo questo protocollo per esplorare composizione come atmosferica o un ambiente di ossigeno basso colpisce la classificazione di polarizzazione del macrofago.
Introduction
I macrofagi sono cellule dell’immunità innata coinvolti in una serie di funzioni fisiologiche che vanno dalle risposte agli agenti patogeni infettivi all’omeostasi del tessuto, compresa la rimozione delle cellule apoptotiche e rimodellamento della matrice extracellulare1. Queste cellule sono caratterizzate da una forte plasticità fenotipica2 che si traduce in un molti Stati di attivazione possibili, che sono anche chiamati polarizzazioni. La precisa descrizione molecolare di queste varie polarizzazioni è una priorità nel campo della biologia di macrofago3. È stato proposto di classificare queste polarizzazioni utilizzando la cosiddetta dicotomia M1/M2, in cui M1 rappresenta pro-infiammatorie e M2 rappresenta i macrofagi infiammatori. Questo modello si adatta bene in varie situazioni patologiche, come le infezioni acute, l’allergia e l’obesità4. Tuttavia, in tessuti cronicamente infiammati e cancro, è stato dimostrato che questa classificazione è in grado di cogliere il vasto repertorio fenotipico che i macrofagi presentano in determinati ambienti cellulari5,6, 7. il consenso corrente è che la polarizzazione del macrofago è meglio descritto utilizzando un modello multidimensionale di integrare segnali specifici microambientali8. Questa conclusione è stata confermata attraverso l’analisi trascrittomica dei macrofagi umani, mostrando che il modello M1/M2 è inefficiente nel descrivere le polarizzazioni ottenuti9.
Lo studio presentato si propone di fornire un protocollo per ottenere le firme di proteomica di varie polarizzazioni in macrofagi umani. Descriviamo come differenziare i macrofagi umani negli ambienti dei vari livelli di ossigeno e ottenere peptidi dal macrofago intero proteoma per eseguire una quantificazione privo di etichetta. Questa quantificazione permette il confronto dei livelli di espressione di varie proteine. Come la ricerca sulle cellule staminali ha rivelato l’importanza di ossigeno come un parametro chiave ambientale10, cerchiamo di capire come questo parametro di tessuto può influenzare la polarizzazione del macrofago in esseri umani. La pressione parziale di ossigeno è stata trovata per gamma da 3 a 20% (del totale pressione atmosferica) nel corpo umano, dove il 20% corrisponde approssimativamente a quello comunemente usato in un’incubatrice di coltura cellulare (il valore esatto è di circa 18,6% durante l’assunzione di presenza di acqua in considerazione).
Il lavoro precedente ha indicato che alveolare differiscono dai macrofagi interstiziali da funzionale e morfologica punto di vista11 e che queste differenze sono probabilmente parzialmente dovuto i livelli di ossigeno differente a cui sono esposte12. Inoltre, derivate da midollo osseo macrofagi mostrano una maggiore capacità di phagocytize batteri quando esposti ad un ambiente di ossigeno basso12. L’effetto opposto è stato trovato per macrofagi umani differenziati THP113, ma questi risultati sostengono l’idea che l’ossigeno è un regolatore della biologia del macrofago e che è necessario chiarire questo ruolo a livello molecolare in macrofagi umani. In uno studio precedente, abbiamo applicato un approccio di proteomica per risolvere questi problemi. Misurando i livelli di espressione di migliaia di proteine contemporaneamente, abbiamo messo in evidenza l’impatto di ossigeno sulla polarizzazione e fornito un elenco di nuovi marcatori molecolari. Siamo stati anche in grado di correlare questi risultati per alcune funzioni di macrofagi. In particolare, abbiamo trovato che il tasso di fagocitosi delle cellule apoptotiche aumentava nei macrofagi IL4/IL13-polarizzato, che era legato al upregulation di ALOX15, come rivela l’ analisi proteomica14. Nello studio presente, descriviamo come effettuare tale analisi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Perché la proteomica è un potente strumento per studiare l’espressione di proteine differenti da una cellula intera o compartimenti subcellulari, ottimizzazione del protocollo lisi cellulare e digestione delle proteine è stati affrontati da una serie di studi. Ci sono tre classi principali di metodi, che includono la digestione in-gel (digestione delle proteine nella matrice del gel di poliacrilammide)17, digestione in soluzione18 e filtro-aided campione preparazione<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AM è finanziato dal programma Leader di gruppo di giovani (ATIP/Avenir Inserm-CNRS), la Ligue Nationale contre le Cancer e la ARC Fondation pour la recherche sur le Cancer. Ringraziamo Mariette Matondo dalla spettrometria di massa per la piattaforma di biologia (UTECHS MSBIO, Istituto Pasteur, Parigi). Ringraziamo Lauren Anderson per la sua lettura del manoscritto.
Materials
| Hypoxia Working Station | Oxford Optronix | Hypoxylab | |
| C6 Flow cytometer | BD | Accuri C6 | |
| Urea | Agilent Technologies | 5188-6435 | |
| Formic acid (FA) | ARISTAR | 450122M | |
| R-250 Coomassie blue | Biorad | 1,610,436 | |
| Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS) | Calbiochem | 437627 | |
| 2D clean-up kit | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| RPMI 1640 medium, glutamax supplement | Gibco | 61870044 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X | Gibco | 11140-035 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X | Gibco | 14190-094 | |
| Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column | Harvard Apparatus | 74-4601 | |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| NuPAGE Bis-Tris 4-12% | Life Technologies SAS | NP0321 BOX | |
| CD14 Microbeads human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| MACS separation column LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) | Miltenyi Biotec | 130-096-485 | |
| Interleukin 4 (IL4) | Miltenyi Biotec | 130-093-917 | |
| Interleukin 13 (IL13) | Miltenyi Biotec | 130-112-410 | |
| Interferon gamma (INFγ) | Miltenyi Biotec | 130-096-482 | |
| CD14-FITC (clone TÜK4) | Miltenyi Biotec | 130-080-701 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Pierce | 28904 | |
| Trypsin/Lys-C Mix | PROMEGA | V5073 | |
| Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Density Gradient Solution (Histopaque 1077) | Sigma Aldrich | 10771-100ML | |
| Accumax | Sigma Aldrich | A7089-100ML | |
| Human Serum from human male AB plasma (SAB) | Sigma Aldrich | H4522-100ML | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30% | Sigma Aldrich | A9576-50ML | |
| Trisma-base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | 49767 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | 114405 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20% | Sigma Aldrich | 5030 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 9830 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34888 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Iodoacetamide | Sigma Aldrich | 57670 | |
| Thiourea | Sigma Aldrich | T8656 | |
| CHAPS | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Micro BCA Assay Kit | ThermoFisher | 23235 | |
| 5 mL sterile plastic pipette | VWR | 612-1685 | |
| Thermomixer C Eppendorf | VWR | 460-0223 | |
| Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg | Waters | WAT036820 |
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