Proteomic analyse av menneskelig Macrophage polarisering Under et lavt oksygeninnhold miljø
Summary
Vi presenterer en protokoll for å skaffe proteomic signaturer av menneskelig makrofager og dette gjelder fastsettelse av virkningen av et lavt oksygeninnhold miljø macrophage polarisering.
Abstract
Makrofager er medfødte immunceller involvert i en rekke fysiologiske funksjoner mellom Svar å smittsomme patogener vev homeostase. De forskjellige funksjonene i disse cellene er knyttet til deres aktivisering stater, som også kalles polarisering. Den presise molekylære beskrivelsen av disse ulike polarisasjonene prioriteres innen macrophage biologi. Det er nå anerkjent som en flerdimensjonal tilnærming er nødvendig å beskrive hvordan polarisering er kontrollert av Miljøsignaler. I denne rapporten beskriver vi utviklet å få proteomic signaturen av ulike polarisasjonene i menneskelig makrofager. Denne protokollen er basert på en etikett-fri kvantifisering av macrophage protein uttrykk innhentet fra in-gel fraksjonert og Lys C/trypsin-fordøyd mobilnettet lysis innhold. Vi tilbyr også en protokoll basert på-løsning fordøyelsen og isoelectric fokuserer fraksjoneres å bruke som et alternativ. Oksygen konsentrasjon er relevante miljømessige parameter i vev, vi bruk denne protokollen til å utforske hvordan atmosfærens sammensetning eller et lavt oksygeninnhold miljø påvirker klassifiseringen av macrophage polarisering.
Introduction
Makrofager er medfødte immunceller involvert i en rekke fysiologiske funksjoner mellom Svar å smittsomme patogener vev homeostase, inkludert fjerning av apoptotisk celler og ombygging av ekstracellulær matrix1. Disse cellene er preget av en sterk fenotypiske plastisitet2 som oversetter til en mange mulig aktivering stater, også kalt polarisasjonene. Den presise molekylære beskrivelsen av disse ulike polarisasjonene prioriteres innen macrophage biologi3. Det har blitt foreslått å klassifisere disse polarisasjonene bruker den såkalte M1/M2 motsetningen, der M1 representerer pro-inflammatoriske og M2 representerer anti-inflammatorisk makrofager. Denne modellen passer godt i ulike patologisk situasjoner som akutte infeksjoner, allergi og fedme4. Men i kronisk betent vev og kreft, har det vært vist at klassifiseringen er i stand til å forstå bred fenotypiske repertoaret makrofager presenterer i visse mobilnettet miljøer5,6, 7. den gjeldende konsensus er at macrophage polarisering er bedre beskrevet med en flerdimensjonal modell for å integrere microenvironmental sender8. Denne konklusjonen er bekreftet gjennom transcriptomic analyse av menneskelig makrofager viser at M1/M2 modellen er ineffektive i beskriver innhentet polarisasjonene9.
Studien presentert mål å gi en protokoll for å få proteomic signaturer av ulike polarisasjonene i menneskelig makrofager. Vi beskriver hvordan å skille menneskelig makrofager i miljøer med ulike oksygennivået og få peptider fra hele macrophage proteom til å utføre en etikett-fri kvantifisering. Denne kvantifisering tillater sammenligning av uttrykket nivåer av. Som forskning på stamceller har avdekket betydningen av oksygen som en miljømessig Nøkkelparameteren10, søker vi å forstå hvordan denne vev-parameteren kan påvirke macrophage polarisering i mennesker. Delvis trykket av oksygen har funnet å rekkevidde fra 3 til 20% (av totale lufttrykk) i menneskekroppen, der 20% tilsvarer omtrent til hva er vanligvis brukes i en celle kultur inkubator (den nøyaktige verdien er rundt 18.6% mens du tar er tilstedeværelsen av vann i betraktning).
Tidligere arbeid har vist at alveolar avvike fra interstitiell makrofager fra funksjonelle og morfologiske hensikten utsikt11 og som disse forskjellene er trolig delvis på grunn av ulike oksygen nivåer som de er utsatt12. Videre viser Ben margtransplantasjon-avledet makrofager en økt evne til å phagocytize bakterier utsettes for en oksygen miljø12. Motsatte er funnet for THP1-differensiert menneskelige makrofager13, men disse resultatene støtter ideen om at oksygen er en regulator macrophage biologi og at det er nødvendig å avklare denne rollen på molekylært nivå i menneskelig makrofager. I en tidligere studie, har vi brukt en Proteomikk tilnærming for å løse disse problemene. Ved å måle uttrykk nivåer for tusenvis av proteiner samtidig, vi fremhevet virkningen av oksygen på polarisering og laget en liste over nye molekylære markører. Vi var også i stand til å relatere disse funnene til noen makrofager funksjoner. Spesielt fant vi at frekvensen av fagocytose apoptotisk celler ble økt i IL4/IL13-polarisert makrofager, som var knyttet til oppregulering av ALOX15 som åpenbart av proteomic analyse14. I studien beskriver vi hvordan du utfører slik analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Proteomikk er et kraftig verktøy for å studere uttrykk for ulike proteiner fra en hel celle eller subcellular rom, er optimalisering av cellen lysis protokollen og fordøyelse av proteiner rettet av en rekke studier. Det er tre hovedgrupper av metoder, inkluderer i-gel fordøyelse (fordøyelsen av proteiner i polyakrylamid gel matrix)17, fordøyelsen løsning18 og filter-hjulpet eksempel forberedelse19. Denne siste metoden, først beskrevet som uni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AM er finansiert av unge gruppen leder Program (ATIP/Avenir Inserm-CNRS), av la Ligue Nationale contre le kreft og la ARC Fondation pour la recherche sur le kreft. Vi takker Mariette Matondo fra massespektrometri for biologi plattformen (UTECHS MSBIO, Pasteur Institute, Paris). Vi takker Lauren Anderson for hennes av manuskriptet.
Materials
| Hypoxia Working Station | Oxford Optronix | Hypoxylab | |
| C6 Flow cytometer | BD | Accuri C6 | |
| Urea | Agilent Technologies | 5188-6435 | |
| Formic acid (FA) | ARISTAR | 450122M | |
| R-250 Coomassie blue | Biorad | 1,610,436 | |
| Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS) | Calbiochem | 437627 | |
| 2D clean-up kit | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| RPMI 1640 medium, glutamax supplement | Gibco | 61870044 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X | Gibco | 11140-035 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X | Gibco | 14190-094 | |
| Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column | Harvard Apparatus | 74-4601 | |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| NuPAGE Bis-Tris 4-12% | Life Technologies SAS | NP0321 BOX | |
| CD14 Microbeads human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| MACS separation column LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) | Miltenyi Biotec | 130-096-485 | |
| Interleukin 4 (IL4) | Miltenyi Biotec | 130-093-917 | |
| Interleukin 13 (IL13) | Miltenyi Biotec | 130-112-410 | |
| Interferon gamma (INFγ) | Miltenyi Biotec | 130-096-482 | |
| CD14-FITC (clone TÜK4) | Miltenyi Biotec | 130-080-701 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Pierce | 28904 | |
| Trypsin/Lys-C Mix | PROMEGA | V5073 | |
| Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Density Gradient Solution (Histopaque 1077) | Sigma Aldrich | 10771-100ML | |
| Accumax | Sigma Aldrich | A7089-100ML | |
| Human Serum from human male AB plasma (SAB) | Sigma Aldrich | H4522-100ML | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30% | Sigma Aldrich | A9576-50ML | |
| Trisma-base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | 49767 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | 114405 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20% | Sigma Aldrich | 5030 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 9830 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34888 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Iodoacetamide | Sigma Aldrich | 57670 | |
| Thiourea | Sigma Aldrich | T8656 | |
| CHAPS | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Micro BCA Assay Kit | ThermoFisher | 23235 | |
| 5 mL sterile plastic pipette | VWR | 612-1685 | |
| Thermomixer C Eppendorf | VWR | 460-0223 | |
| Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg | Waters | WAT036820 |
References
- Okabe, Y., Medzhitov, R. Tissue biology perspective on macrophages. Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).
- Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).
- Murray, P. J. Macrophage Polarization. Annual Review of Physiology. 79, 541-566 (2017).
- Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. Macrophage polarization in metabolic disorders: functions and regulation. Current Opinion in Lipidology. 22 (5), 365-372 (2011).
- Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
- Xue, J., et al. Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation. Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).
- Csete, M. Oxygen in the cultivation of stem cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 1-8 (2005).
- Johansson, A., et al. Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 16 (5), 582-588 (1997).
- Pfau, J. C., Schneider, J. C., Archer, A. J., Sentissi, J., Leyva, F. J., Cramton, J. Environmental oxygen tension affects phenotype in cultured bone marrow-derived macrophages. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (2), L354-L362 (2004).
- Grodzki, A. C. G., Giulivi, C., Lein, P. J. Oxygen tension modulates differentiation and primary macrophage functions in the human monocytic THP-1 cell line. PLoS One. 8 (1), e54926 (2013).
- Court, M., Petre, G., Atifi, M. E., Millet, A. Proteomic Signature Reveals Modulation of Human Macrophage Polarization and Functions Under Differing Environmental Oxygen Conditions. Molecular & Cellular Proteomics. 16 (12), 2153-2168 (2017).
- Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Cox, J., Neuhauser, N., Michalski, A., Scheltema, R. A., Olsen, J. V., Mann, M. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Court, M., et al. Toward a standardized urine proteome analysis methodology. Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).
- Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
- Liebler, D. C., Ham, A. -. J. L. Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics. Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).
- Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis. Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).
- Park, J., et al. Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics. Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).
- Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of oxygen and culture media on plating efficiency of some mammalian tissue cells. Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
- Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).
- Lengner, C. J., et al. Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations. Cell. 141 (5), 872-883 (2010).
- Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology. Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).
