Análise de Proteomic do macrófago humano polarização sob um ambiente de baixo oxigênio
Summary
Apresentamos um protocolo para obter assinaturas de proteomic de macrófagos humanos e aplicar isso a determinação do impacto de um ambiente de baixo oxigênio na polarização do macrófago.
Abstract
Os macrófagos são células do sistema imune inatas envolvido com uma série de funções fisiológicas, variando das respostas de patógenos infecciosos a homeostase do tecido. As várias funções dessas células estão relacionadas aos seus Estados de ativação, que é também chamado de polarização. A descrição molecular precisa destas várias polarizações é uma prioridade no campo da biologia do macrófago. Atualmente é reconhecido que uma abordagem multidimensional é necessária para descrever como a polarização é controlada por sinais ambientais. Neste relatório, descrevemos um protocolo projetado para obter a assinatura de proteomic de várias polarizações em macrófagos humanos. Este protocolo é baseado em uma rótulo livre quantificação da expressão da proteína de macrófago obtido de fracionada em gel e conteúdo de lise celular Lys C/tripsina-digerido. Nós também fornecemos um protocolo baseado na solução de digestão e isoeléctrico focando fracionamento para usar como uma alternativa. Porque a concentração de oxigênio é um parâmetro ambiental relevante nos tecidos, usamos este protocolo para explorar a composição atmosférica como ou um ambiente de baixo oxigênio afeta a classificação de polarização de macrófagos.
Introduction
Os macrófagos são células do sistema imune inatas envolvido com uma série de funções fisiológicas, variando das respostas de patógenos infecciosos a homeostase do tecido, incluindo a remoção de pilhas apoptotic e remodelação da matriz extracelular1. Estas células são caracterizadas por uma forte plasticidade fenotípica2 , que se traduz em um muitos Estados possíveis de ativação, que também são chamados de polarizações. A descrição molecular precisa destas várias polarizações é uma prioridade no campo do macrófago biologia3. Foi proposto para classificar estas polarizações usando a chamados dicotomia M1/M2, em que M1 representa pro-inflamatórios e M2 representa macrófagos anti-inflamatórios. Este modelo se encaixa bem em diversas situações patológicas, como infecções agudas, alergia e obesidade4. No entanto, em tecidos cronicamente inflamados e câncer, foi demonstrado que esta classificação é incapaz de compreender o amplo repertório fenotípico que macrófagos presentes em certos ambientes celulares5,6, 7. o consenso atual é que polarização macrófago é melhor descrita usando um modelo multidimensional para integrar sinais específicos microenvironmental8. Esta conclusão foi confirmada através da análise de transcriptomic de macrófagos humanos, mostrando que o modelo M1/M2 é ineficiente em descrever as polarizações obtidos9.
O estudo apresentado tem como objetivo proporcionar um protocolo para obter assinaturas de proteomic de várias polarizações em macrófagos humanos. Descrevemos como diferenciar os macrófagos humanos em ambientes de vários níveis de oxigênio e obter peptídeos o proteome macrófago toda para realizar uma rótulo livre de quantificação. Esta quantificação permite a comparação dos níveis de expressão de várias proteínas. Como pesquisas sobre células-tronco tem revelado a importância de oxigênio como um parâmetro chave ambiental10, procuramos entender como esse parâmetro de tecido pode influenciar a polarização do macrófago em seres humanos. A pressão parcial de oxigênio foi encontrada para o intervalo de 3 a 20% (de pressão atmosférica total) no corpo humano, onde 20% corresponde mais ou menos o que é comumente usado em uma incubadora de cultura celular (o valor exato é de cerca de 18,6%, tendo a presença de água em conta).
Trabalhos anteriores tem mostrado que alveolar diferem dos macrófagos intersticiais de funcionais e morfológico ponto de vistas11 e que essas diferenças são provavelmente parcialmente devido aos níveis de oxigênio diferentes a que estão expostos12. Além disso, os macrófagos da medula óssea-derivado mostram uma habilidade aumentada para phagocytize bactérias quando expostos a um ambiente de oxigênio baixo12. O efeito oposto foi encontrado por macrófagos humanos diferenciadas THP113, mas estes resultados suportam a ideia de que o oxigênio é um regulador da biologia do macrófago e que é necessário clarificar este papel a nível molecular em macrófagos humanos. Em um estudo anterior, nós aplicamos uma abordagem proteômica para solucionar esses problemas. Medindo os níveis de expressão de milhares de proteínas simultaneamente, nós destacou o impacto do oxigênio na polarização e forneceu uma lista de novos marcadores moleculares. Também fomos capazes de relacionar esses achados para algumas funções de macrófagos. Em particular, nós encontramos que a taxa de fagocitose das células apoptóticas foi aumentada em macrófagos IL4/IL13-polarizada, que estava relacionado com o upregulation de ALOX15, como revelado pela análise proteômica14. No presente estudo, descrevemos como executar tal análise.
Protocol
Representative Results
Discussion
Porque proteomics é uma poderosa ferramenta para estudar a expressão de diferentes proteínas de uma célula inteira ou compartimentos subcelulares, otimização do protocolo de lise celular e digestão de proteínas tem sido abordadas por um número de estudos. Existem três classes principais de métodos, que incluem em-gel digestão (digestão de proteínas em gel de poliacrilamida matriz)17, digestão em solução18 e de preparação de amostra auxiliado por filtro<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AM é financiado pelo programa de líder do grupo de jovens (ATIP/Avenir Inserm-CNRS), por la Ligue Nationale contre le Cancer e la ARC da Fondation pour la recherche sur le Cancer. Agradecemos a Mariette Matondo partir a espectrometria de massa para a plataforma de biologia (UTECHS MSBIO, Instituto Pasteur, Paris). Agradecemos a Lauren Anderson para a leitura do manuscrito.
Materials
| Hypoxia Working Station | Oxford Optronix | Hypoxylab | |
| C6 Flow cytometer | BD | Accuri C6 | |
| Urea | Agilent Technologies | 5188-6435 | |
| Formic acid (FA) | ARISTAR | 450122M | |
| R-250 Coomassie blue | Biorad | 1,610,436 | |
| Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS) | Calbiochem | 437627 | |
| 2D clean-up kit | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| RPMI 1640 medium, glutamax supplement | Gibco | 61870044 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X | Gibco | 11140-035 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X | Gibco | 14190-094 | |
| Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column | Harvard Apparatus | 74-4601 | |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| NuPAGE Bis-Tris 4-12% | Life Technologies SAS | NP0321 BOX | |
| CD14 Microbeads human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| MACS separation column LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) | Miltenyi Biotec | 130-096-485 | |
| Interleukin 4 (IL4) | Miltenyi Biotec | 130-093-917 | |
| Interleukin 13 (IL13) | Miltenyi Biotec | 130-112-410 | |
| Interferon gamma (INFγ) | Miltenyi Biotec | 130-096-482 | |
| CD14-FITC (clone TÜK4) | Miltenyi Biotec | 130-080-701 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Pierce | 28904 | |
| Trypsin/Lys-C Mix | PROMEGA | V5073 | |
| Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Density Gradient Solution (Histopaque 1077) | Sigma Aldrich | 10771-100ML | |
| Accumax | Sigma Aldrich | A7089-100ML | |
| Human Serum from human male AB plasma (SAB) | Sigma Aldrich | H4522-100ML | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30% | Sigma Aldrich | A9576-50ML | |
| Trisma-base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | 49767 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | 114405 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20% | Sigma Aldrich | 5030 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 9830 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34888 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Iodoacetamide | Sigma Aldrich | 57670 | |
| Thiourea | Sigma Aldrich | T8656 | |
| CHAPS | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Micro BCA Assay Kit | ThermoFisher | 23235 | |
| 5 mL sterile plastic pipette | VWR | 612-1685 | |
| Thermomixer C Eppendorf | VWR | 460-0223 | |
| Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg | Waters | WAT036820 |
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