Análisis proteómico de polarización macrófago humano bajo un ambiente de poco oxígeno
Summary
Presentamos un protocolo para obtener firmas de Proteómica de macrófagos humanos y aplicar esto a la determinación del impacto de un ambiente de poco oxígeno en polarización de macrófagos.
Abstract
Los macrófagos son las células inmunes innatas involucrados en una serie de funciones fisiológicas que van desde las respuestas a patógenos infecciosos a la homeostasis del tejido. Las diferentes funciones de estas células están relacionadas con sus Estados de activación, que también se llama polarización. La descripción molecular precisa de estas polarizaciones diferentes es una prioridad en el campo de la biología del macrófago. Actualmente se reconoce que un enfoque multidimensional es necesario describir cómo la polarización es controlada por señales ambientales. En este informe, describimos un protocolo diseñado para obtener la firma proteómica de diferentes polarizaciones en macrófagos humanos. Este protocolo se basa en una cuantificación de etiqueta-libre de expresión de la proteína del macrófago obtenida de in-gel fraccionado y Lys C/tripsina-digerido contenido de lisis celular. También proporcionamos un protocolo basado en la solución en digestión y fraccionamiento para usar como una alternativa de enfoque isoeléctrico. Debido a la concentración de oxígeno es un parámetro ambiental relevante en los tejidos, utilizamos este protocolo para explorar la composición de la atmósfera o un ambiente de poco oxígeno afecta a la clasificación de la polarización del macrófago.
Introduction
Los macrófagos son las células inmunes innatas involucrados en una serie de funciones fisiológicas que van desde las respuestas a patógenos infecciosos a la homeostasis del tejido, incluyendo la remoción de células apoptóticas y la remodelación de la matriz extracelular1. Estas células se caracterizan por una fuerte plasticidad fenotípica2 que se traduce en unas muchos Estados posible activación, que también se llaman polarizaciones. La descripción molecular precisa de estas polarizaciones diferentes es una prioridad en el campo de la biología de macrófagos3. Se ha propuesto clasificar estas polarizaciones utilizando la llamada dicotomía M1/M2, M1 representa pro-inflamatoria y M2 representa macrófagos antiinflamatorios. Este modelo se ajusta bien en diferentes situaciones patológicas como infecciones agudas, alergias y obesidad4. Sin embargo, en los tejidos crónicamente inflamados y cáncer, se ha demostrado que esta clasificación es incapaz de captar el amplio repertorio fenotípico que los macrófagos presentan en determinados ambientes celulares5,6, 7. el consenso actual es que polarización macrófago se describe mejor usando un modelo multidimensional para integrar señales microambiental específicas8. Esta conclusión ha sido confirmada mediante análisis transcriptómico de macrófagos humanos que muestra que el modelo M1/M2 es ineficiente en la descripción de las polarizaciones obtuvo9.
El estudio presentado tiene como objetivo ofrecer un protocolo para obtener firmas de Proteómica de diferentes polarizaciones en macrófagos humanos. Describimos cómo diferenciar los macrófagos humanos en entornos de varios niveles de oxígeno y obtener péptidos de proteoma todo macrófagos para llevar a cabo una cuantificación de etiqueta-libre. Esta cuantificación permite la comparación de los niveles de expresión de diversas proteínas. Como investigación en células madre ha puesto de manifiesto la importancia del oxígeno como un parámetro clave ambiental10, buscamos entender cómo este parámetro de tejido puede influir polarización de macrófagos en los seres humanos. La presión parcial de oxígeno se ha encontrado al rango de 3 a 20% (de la presión atmosférica total) en el cuerpo humano, donde el 20% corresponde aproximadamente a lo que comúnmente se utiliza en una incubadora de cultivo celular (el valor exacto es alrededor 18.6% mientras que la presencia de agua en cuenta).
Trabajo previo ha demostrado que difieren alveolar de macrófagos intersticiales de funcional y morfológico punto de vista11 y estas diferencias son probablemente parcialmente debido a los niveles de oxígeno diferentes a los que están expuestos12. Además, macrófagos derivados de médula ósea muestran una mayor capacidad que fagocitan bacterias cuando están expuestos a un bajo nivel de oxígeno medio ambiente12. El efecto contrario se ha encontrado para macrófagos humanos THP1 distinguido13, pero estos resultados apoyan la idea de que el oxígeno es un regulador de la biología del macrófago y que es necesario aclarar esta función a nivel molecular en macrófagos humanos. En un estudio anterior, hemos aplicado un enfoque de la proteómica para tratar estos temas. Al medir los niveles de expresión de miles de proteínas al mismo tiempo, destacó el impacto del oxigeno sobre polarización y proporciona una lista de nuevos marcadores moleculares. También fuimos capaces de relacionar estos resultados para algunas funciones de los macrófagos. En particular, encontramos que la tasa de fagocitosis de células apoptóticas se incrementó en macrófagos IL4/IL13-polarizado, que estuvo vinculado a la regulación al alza de ALOX15 según lo revelado por el análisis proteómico del14. En el presente estudio, describimos cómo realizar tal análisis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Porque la proteómica es una poderosa herramienta para estudiar la expresión de diferentes proteínas de una célula entera o compartimentos subcelulares, optimización del Protocolo de lisis celular y la digestión de las proteínas ha sido abordados por diversos estudios. Hay tres clases principales de métodos, que son en gel de la digestión (digestión de proteínas en geles de poliacrilamida matriz)17, digestión en solución18 y asistido por el filtro muestra prepar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AM es financiado por el programa de líder del grupo de jóvenes (ATIP/Avenir Inserm-CNRS), de la Ligue Nationale contre le cáncer y la Fundación arco pour la recherche sur le Cancer. Agradecemos a Mariette Matondo de la espectrometría de masas para plataforma de Biología (UTECHS MSBIO, Instituto Pasteur, París). Agradecemos a Lauren Anderson por su lectura del manuscrito.
Materials
| Hypoxia Working Station | Oxford Optronix | Hypoxylab | |
| C6 Flow cytometer | BD | Accuri C6 | |
| Urea | Agilent Technologies | 5188-6435 | |
| Formic acid (FA) | ARISTAR | 450122M | |
| R-250 Coomassie blue | Biorad | 1,610,436 | |
| Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS) | Calbiochem | 437627 | |
| 2D clean-up kit | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| RPMI 1640 medium, glutamax supplement | Gibco | 61870044 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X | Gibco | 11140-035 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X | Gibco | 14190-094 | |
| Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column | Harvard Apparatus | 74-4601 | |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| NuPAGE Bis-Tris 4-12% | Life Technologies SAS | NP0321 BOX | |
| CD14 Microbeads human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| MACS separation column LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) | Miltenyi Biotec | 130-096-485 | |
| Interleukin 4 (IL4) | Miltenyi Biotec | 130-093-917 | |
| Interleukin 13 (IL13) | Miltenyi Biotec | 130-112-410 | |
| Interferon gamma (INFγ) | Miltenyi Biotec | 130-096-482 | |
| CD14-FITC (clone TÜK4) | Miltenyi Biotec | 130-080-701 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Pierce | 28904 | |
| Trypsin/Lys-C Mix | PROMEGA | V5073 | |
| Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Density Gradient Solution (Histopaque 1077) | Sigma Aldrich | 10771-100ML | |
| Accumax | Sigma Aldrich | A7089-100ML | |
| Human Serum from human male AB plasma (SAB) | Sigma Aldrich | H4522-100ML | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30% | Sigma Aldrich | A9576-50ML | |
| Trisma-base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | 49767 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | 114405 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20% | Sigma Aldrich | 5030 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 9830 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34888 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Iodoacetamide | Sigma Aldrich | 57670 | |
| Thiourea | Sigma Aldrich | T8656 | |
| CHAPS | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Micro BCA Assay Kit | ThermoFisher | 23235 | |
| 5 mL sterile plastic pipette | VWR | 612-1685 | |
| Thermomixer C Eppendorf | VWR | 460-0223 | |
| Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg | Waters | WAT036820 |
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