Kvantitativ Immunoblotting cellen linjer som Standard til å validere Immunofluorescence for kvantifisering biomarkør proteiner i rutinemessig vevsprøver
Summary
Vi beskriver bruken av kvantitative immunoblotting å validere immunofluorescence histology kombinert med bildeanalyser for kvantifisere et protein av interesse i formalin-fast, parafin-embedded (FFPE)-vevsprøver. Våre resultater viser nytten av immunofluorescence histology for konstatere relative antallet biomarkør proteiner i rutinemessig biopsi prøver.
Abstract
Kvantifisering av proteiner av interesse i formalin-fast, parafin-embedded (FFPE)-vevsprøver er viktig i klinisk og forskning programmer. En optimal metode for kvantifisering nøyaktig, har en rekke med lineær dynamiske og opprettholder den strukturelle integriteten for eksempel tillate for identifikasjon av personlige celletyper. Gjeldende metoder som immunohistochemistry (IHC), massespektrometri og immunoblotting hver ikke oppfyller disse bestemmelsene på grunn av deres kategoriske natur eller må homogenize prøven. Som en alternativ foreslår vi bruk av immunofluorescence (hvis) og bildeanalyse å bestemme den relative overfloden av et protein av interesse i FFPE vev. Her viser vi at denne metoden er enkelt optimalisert, gir et bredt dynamisk område og er lineært kvantifiserbare i forhold til gullstandarden av kvantitative immunoblotting. Videre, denne metoden tillater vedlikehold av den strukturelle integriteten av utvalget og tillater æren av ulike celletyper, som kan være avgjørende i diagnostiske programmer. Alt dette er en robust metode for den relative kvantifiseringen av proteiner i FFPE prøver og kan lett tilpasses passer klinisk eller forskning må.
Introduction
Behovet for å kvantifisere proteiner i formalin-fast, parafin-embedded (FFPE) biopsi vevsprøver finnes i mange klinisk felt. For eksempel brukes kvantifisering av biomarkør proteiner i rutinemessig biopsi prøver til å belyse prognose og informere behandling for kreft pasienter1. Imidlertid gjeldende metoder er vanligvis subjektive og mangler validering.
Immunohistochemistry (IHC) brukes rutinemessig i rutinelaboratorier og vanligvis avhenger en primær antistoff rettet mot målet protein og en sekundær antistoff konjugert med en enzymatisk etikett som pepperrot peroxidase2. Konvensjonelle IHC følsom, kan gjøre bruk av minutt prøver og beholder morfologiske integriteten av dermed tillater vurdering av protein uttrykk i relevante histologiske konteksten. Men fordi kromogent signalet generert av IHC subtraktiv, det lider et relativt lite dynamisk område og tilbyr begrenset potensial for multiplexing2,3,4. Matrix-assistert laser desorpsjon/ionisering massespektrometri imaging (MALDI-MSI) beholder morfologiske integritet. Men denne utvikle teknologien er forbundet med beskjedne morfologiske oppløsning og krever betydelig kalibrering og normalisering, svekker sine mulighetsstudie for rutinemessige klinisk bruk5,6,7. Alternative teknikker å kvantifisere protein i vevsprøver inkluderer immunoblotting8, massespektrometri9,10,11og enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA)12, hver av som begynner med en homogenisert lysate av prøven vev. Primære vevsprøver er heterogene ved at de inneholder en rekke celletyper. Derfor tillater teknikker som innebærer homogenisere prøvene ikke kvantifisering av et protein i en bestemt celle befolkning av interesse, slik som kreftceller.
Som IHC, hvis aktuelt for små FFPE prøver og tillater oppbevaring av histologiske integritet13. Men takket være additiv natur fluorescens signaler, hvis er mottakelig for anvendelse av flere primære antistoffer og fluorescerende etiketter. Dermed kan et protein av interesse være relativt kvantifisert i bestemte celler eller cellular avdelinger (for eksempel kjernen versus cytoplasma) defineres ved hjelp av andre antistoffer. Fluorescens signaler har også fordelen av en større dynamisk område13,14. Den overlegenhet, reproduserbarhet og multipleksing potensialet i har hvis FFPE prøver vært demonstrert13,14,15.
Her beskriver vi bruk av kvantitative immunoblotting med etablerte cellelinjer som en gullstandard for å fastslå kvantitative natur hvis kombinert med computer-assistert bildeanalyser å bestemme den relative overfloden av et protein av interesse histologiske inndelinger fra FFPE vevsprøver. Vi har brukt denne metoden i en multiplex tilnærming til kvantifisere biomarkør proteiner i klinisk biopsi prøver16,17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har beskrevet en metode som gjør bruk av kvantitative immunoblotting (IB) for å demonstrere nytten av immunofluorescence (hvis) for konstatere relative overflod av et mål protein i FFPE vevsprøver. Gjeldende protein kvantifisering metoder er begrenset av deres kategoriske natur, som kromogent IHC2,3, eller behovet for å homogenize prøver, forebygge etterforskning eksempel struktur og celle populasjoner, som IB og massespektrometri8</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet var delvis finansiert av Fredrick Banting og Charles Best Canada Graduate Scholarship (am).
Materials
| 697 | DSMZ | ACC 42 | Cell line |
| JeKo-1 | ATCC | CRL-3006 | Cell line |
| Jurkat | ATCC | TIB-152 | Cell line |
| RCH-ACV | DSMZ | ACC 548 | Cell line |
| Granta-519 | DSMZ | ACC 342 | Cell line |
| REH | DSMZ | ACC 22 | Cell line |
| Raji | ATCC | CCL-86 | Cell line |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | Cell line |
| Trypsin/EDTA solution | Invitrogen | R001100 | For detaching adhesive cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent Inc. | 81150 | To neutralize trypsin |
| Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | For fixing cell pellets |
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 15517-022 | For casting cell pellets |
| Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124 | Dako (Agilent) | cat#: M088729-2, RRID: 2064429 | To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786 |
| Ventana Discovery XT | Roche | – | For automation of immunofluorescence staining |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse) | Dako (Agilent) | K4000 | For immunofluorescence signal amplification |
| EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit) | Dako (Agilent) | K4002 | For immunofluorescence signal amplification |
| Cyanine 5 tyramide reagent | Perkin Elmer | NEL745001KT | For immunofluorescence signal amplification |
| Aperio ImageScope | Leica Biosystems | – | To view scanned slides |
| HALO image analysis software | Indica Labs | – | For quantification of immunofluorescence |
| Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X) | Thermo Scientific | 1862209 | To add to RIPA buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop | EDT001 | For RIPA buffer |
| NP-40 | BDH Limited | 56009 | For RIPA buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | For RIPA buffer |
| Glycerol | FisherBiotech | BP229 | For Laemlli buffer |
| Bromophenol blue | BioShop | BRO777 | For Laemlli buffer |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0611 | For Laemlli buffer |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB001 | For immunoblot washes |
| Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards) | Bio-Rad | 161-0374 | For running protein gel |
| Filter paper (Extra thick blot paper) | Bio-Rad | 1703969 | For blotting transfer |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | For blotting transfer |
| Trans-blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | For semi-dry transfer |
| Skim milk powder (Nonfat dry milk) | Cell Signaling Technology | 9999S | For blocking buffer |
| Tween 20 | BioShop | TWN510 | For wash buffer |
| GAPDH rabbit monoclonal antibody | Epitomics | 2251-1 | Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C) |
| Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6789, RRID: AB_955439 | Secondary antibody for immunoblot |
| Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6721, RRID: AB_955447 | Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5) |
| Clarity Western ECL substrates | Bio-Rad | 1705060 | For immunoblot signal detection |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Life Sciences | 29083461 | For immunoblot signal detection |
| ImageJ software | Freeware, NIH | – | For densitometry analysis |
References
- Khoury, J. D., et al. Validation of Immunohistochemical Assays for Integral Biomarkers in the NCI-MATCH EAY131 Clinical Trial. Clinical Cancer Research. 24 (3), 521-531 (2018).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G. L., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker insights. 5, 9-20 (2010).
- Seidal, T., Balaton, A. J., Battifora, H. Interpretation and quantification of immunostains. The American journal of surgical pathology. 25 (9), 1204-1207 (2001).
- Rimm, D. L. What brown cannot do for you. Nature Biotechnology. 24 (8), 914-916 (2006).
- Bokhart, M. T., Rosen, E., Thompson, C., Sykes, C., Kashuba, A. D. M., Muddiman, D. C. Quantitative mass spectrometry imaging of emtricitabine in cervical tissue model using infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization. Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (8), 2073-2084 (2015).
- Porta, T., Lesur, A., Varesio, E., Hopfgartner, G. Quantification in MALDI-MS imaging: what can we learn from MALDI-selected reaction monitoring and what can we expect for imaging?. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (8), 2177-2187 (2015).
- Rzagalinski, I., Volmer, D. A. Quantification of low molecular weight compounds by MALDI imaging mass spectrometry – A tutorial review. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1865 (7), 726-739 (2017).
- Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry. ELECTROPHORESIS. 30 (11), 1845-1855 (2009).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Burgess, M. W., Keshishian, H., Mani, D. R., Gillette, M. A., Carr, S. A. Simplified and efficient quantification of low-abundance proteins at very high multiplex via targeted mass spectrometry. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (4), 1137-1149 (2014).
- Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (3), 907-917 (2014).
- Denburg, M. R., et al. Comparison of Two ELISA Methods and Mass Spectrometry for Measurement of Vitamin D-Binding Protein: Implications for the Assessment of Bioavailable Vitamin D Concentrations Across Genotypes. Journal of Bone and Mineral Research. 31 (6), 1128-1136 (2016).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Peck, A. R., et al. Validation of tumor protein marker quantification by two independent automated immunofluorescence image analysis platforms. Modern pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 29 (10), 1143-1154 (2016).
- Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97 (3), 329-334 (2017).
- AlJohani, N., et al. Abundant expression of BMI1 in follicular lymphoma is associated with reduced overall survival. Leukemia and Lymphoma. 59 (9), 2211-2219 (2018).
- Wood, B., et al. Abundant expression of interleukin-21 receptor in follicular lymphoma cells is associated with more aggressive disease. Leukemia and Lymphoma. 54 (6), 1212-1220 (2013).
- Weberpals, J. I., et al. First application of the Automated QUantitative Analysis (AQUA) technique to quantify PTEN protein expression in ovarian cancer: A correlative study of NCIC CTG OV.16. Gynecologic Oncology. 140 (3), 486-493 (2016).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH protocols. , (2008).
- Fedor, H. L., Marzo, A. M. De Practical Methods for Tissue Microarray Construction. Methods in Molecular Medicine. , 89-101 (2005).
- Kajimura, J., Ito, R., Manley, N. R., Hale, L. P. Optimization of Single- and Dual-Color Immunofluorescence Protocols for Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Archival Tissues. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (2), 112-124 (2016).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American journal of medical sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
- Wiedemann, M., Lee, S. J., da Silva, R. C., Visweswaraiah, J., Soppert, J., Sattlegger, E. Simultaneous semi-dry electrophoretic transfer of a wide range of differently sized proteins for immunoblotting. Nature Protocol Exchange. , (2013).
- Delbridge, A. R. D., Grabow, S., Strasser, A., Vaux, D. L. Thirty years of BCL-2: translating cell death discoveries into novel cancer therapies. Nature Reviews Cancer. 16 (2), 99-109 (2016).
- Bosch, M., et al. A bioclinical prognostic model using MYC and BCL2 predicts outcome in relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Haematologica. 103 (2), 288-296 (2018).
- Li, Y., et al. BCL2 mRNA or protein abundance is superior to gene rearrangement status in predicting clinical outcomes in patients with diffuse large B-cell lymphoma. Hematological Oncology. 35, 288-289 (2017).
- Choi, Y. W., et al. High expression of Bcl-2 predicts poor outcome in diffuse large B-cell lymphoma patients with low international prognostic index receiving R-CHOP chemotherapy. International Journal of Hematology. 103 (2), 210-218 (2016).
- . The Human Protein Atlas BCL2 Available from: https://www.proteinatlas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell#rna (2018)
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).
- Zellner, M., Babeluk, R., Diestinger, M., Pirchegger, P., Skeledzic, S., Oehler, R. Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples. ELECTROPHORESIS. 29 (17), 3621-3627 (2008).
- Parra, E. R. Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues. Journal of Cancer Treatment & Diagnostics. 2 (1), 43-53 (2018).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9 (1), 13 (2008).
