Vi beskriver användningen av kvantitativa immunoblotting att validera immunofluorescens histologi tillsammans med bildanalys som ett sätt att kvantifiera ett protein av intresse i formalin-fast, paraffin-inbäddat (FFPE) vävnadsprover. Våra resultat visar nyttan av immunofluorescens histologi för att fastställa den relativa mängden biomarkör proteiner i rutinmässiga biopsiprover.
Kvantifiering av proteiner av intresse i formalin-fast, paraffin-inbäddat (FFPE) vävnadsprover är viktigt i kliniska och forskningsansökningar. En optimal metod för kvantifiering är korrekt, har en bred linjär dynamisk räckvidd och underhåller den strukturella integriteten av provet som möjliggör identifiering av enskilda celltyper. Nuvarande metoder såsom immunhistokemi (IHC), masspektrometri och immunoblotting var misslyckas att uppfylla dessa bestämmelser på grund av sin kategoriska natur eller behöva Homogenisera provet. Som en alternativ metod föreslår vi användningen av immunofluorescens (om) och bildanalys avgöra det relativa överflödet av ett protein av intresse i FFPE vävnader. Häri visar vi att denna metod är enkelt optimerad, ger ett brett dynamiskt omfång och är linjärt kvantifierbara jämfört med den gyllene standarden för kvantitativa immunoblotting. Dessutom denna metod möjliggör upprätthållandet av den strukturella integriteten av provet och tillåter för skillnaden av olika celltyper, som kan vara avgörande för diagnostik program. Övergripande, detta är en robust metod för relativ kvantifiering av proteiner i FFPE-prover och lätt kan anpassas att passa klinisk eller forskningsbehov.
Behovet av att kvantifiera proteiner i formalin-fast, paraffin-inbäddat (FFPE) biopsi vävnadsprover finns i många kliniska områden. Till exempel används kvantifiering av biomarkör proteiner i rutinmässig biopsi prov för att belysa prognos och informera behandling för cancer patienter1. Men nuvarande metoder är vanligtvis subjektiva och saknar validering.
Immunhistokemi (IHC) används rutinmässigt i patologi laboratorier och beror i allmänhet på en primär antikropp riktad mot målproteinet och en sekundär antikropp konjugerat med en enzymatisk etikett såsom pepparrotperoxidas2. Konventionella IHC är känsliga, kan göra användning av minut prover och bevarar den morfologiska integriteten av vävnadsprover som därmed tillåter bedömning av proteinuttryck i dess relevanta histologiska sammanhang. Men eftersom kromogen signalen genereras av IHC är subtraktiv, det lider av ett relativt smalt dynamik och erbjuder begränsad potential för multiplexing2,3,4. Matrix-assisted laser desorption/jonisering masspektrometri imaging (MALDI-MSI) bevarar morfologiska integritet. Dock denna teknikutveckling är associerad med blygsamma morfologiska upplösning och kräver betydande kalibrering och normalisering, försämra dess genomförbarhet för rutinmässig klinisk användning5,6,7. Alternativa tekniker för att kvantifiera protein i vävnadsprover omfattar immunoblotting8, masspektrometri9,10,11och enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)12, varje av som börjar med en homogeniserad lysate av vävnadsprover. Primära vävnadsprover är heterogena i att de innehåller en mängd celltyper. Därför tillåter tekniker som innebär homogenisering proverna inte kvantifiering av ett protein i en viss cell population av intresse, såsom cancerceller.
Liknar IHC, om är tillämplig på små FFPE prover och tillåter lagring av histologiska integritet13. Men tack vare tillsatsen natur av fluorescens signaler, om är mottagliga för tillämpningen av flera primära antikroppar och fluorescerande etiketter. Således kan ett protein av intresse kvantifieras relativt inom specifika celler eller cellulära fack (exempelvis nucleus kontra cytoplasman) definieras med andra antikroppar. Fluorescens signaler har också fördelen av en större dynamiskt omfång13,14. Den överlägsenhet, reproducerbarhet och multiplexering potential har om tillämpas på FFPE prover visat13,14,15.
Detta dokument beskriver vi användningen av kvantitativa immunoblotting använder etablerade cellinjer som en guld-standard för att fastställa kvantitativa beskaffenhet om tillsammans med datorstödd bildanalys för att fastställa det relativa överflödet av ett protein av intresse i histologiska sektioner från FFPE vävnadsprover. Vi har tillämpat denna metod framgångsrikt i en multiplex strategi att kvantifiera biomarkör proteiner i kliniska biopsi prov16,17,18.
Vi har beskrivit en metod som använder kvantitativa immunoblotting (IB) för att påvisa nyttan av immunofluorescens (om) för att fastställa det relativa överflödet av ett målprotein i FFPE vävnadsprover. Nuvarande metoder för kvantifiering av protein är begränsade av sin kategoriska natur, såsom kromogen IHC2,3, eller att behöva homogenisera prover, förhindra utredning prov struktur och cell befolkningen, såsom med IB och masspektrometri<sup class=…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades delvis av Fredrick Banting och Charles Best Kanada Graduate stipendium (A.M.).
697 | DSMZ | ACC 42 | Cell line |
JeKo-1 | ATCC | CRL-3006 | Cell line |
Jurkat | ATCC | TIB-152 | Cell line |
RCH-ACV | DSMZ | ACC 548 | Cell line |
Granta-519 | DSMZ | ACC 342 | Cell line |
REH | DSMZ | ACC 22 | Cell line |
Raji | ATCC | CCL-86 | Cell line |
HeLa | ATCC | CCL-2 | Cell line |
Trypsin/EDTA solution | Invitrogen | R001100 | For detaching adhesive cells |
Fetal bovine serum (FBS) | Wisent Inc. | 81150 | To neutralize trypsin |
Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | For fixing cell pellets |
UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 15517-022 | For casting cell pellets |
Mouse monoclonal anti-human Bcl-2 antibody, clone 124 | Dako (Agilent) | cat#: M088729-2, RRID: 2064429 | To detect Bcl-2 by immunoflourencence and immunoblot (lot#: 00095786 |
Ventana Discovery XT | Roche | – | For automation of immunofluorescence staining |
EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-mouse) | Dako (Agilent) | K4000 | For immunofluorescence signal amplification |
EnVision+ System- HRP labelled polymer (anti-rabbit) | Dako (Agilent) | K4002 | For immunofluorescence signal amplification |
Cyanine 5 tyramide reagent | Perkin Elmer | NEL745001KT | For immunofluorescence signal amplification |
Aperio ImageScope | Leica Biosystems | – | To view scanned slides |
HALO image analysis software | Indica Labs | – | For quantification of immunofluorescence |
Protease inhibitors (Halt protease inhibitor cocktail, 100X) | Thermo Scientific | 1862209 | To add to RIPA buffer |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BioShop | EDT001 | For RIPA buffer |
NP-40 | BDH Limited | 56009 | For RIPA buffer |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | For RIPA buffer |
Glycerol | FisherBiotech | BP229 | For Laemlli buffer |
Bromophenol blue | BioShop | BRO777 | For Laemlli buffer |
Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0611 | For Laemlli buffer |
Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB001 | For immunoblot washes |
Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards) | Bio-Rad | 161-0374 | For running protein gel |
Filter paper (Extra thick blot paper) | Bio-Rad | 1703969 | For blotting transfer |
Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | For blotting transfer |
Trans-blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | For semi-dry transfer |
Skim milk powder (Nonfat dry milk) | Cell Signaling Technology | 9999S | For blocking buffer |
Tween 20 | BioShop | TWN510 | For wash buffer |
GAPDH rabbit monoclonal antibody | Epitomics | 2251-1 | Primary antibody of control protein (lot#: YE101901C) |
Goat anti-mouse IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6789, RRID: AB_955439 | Secondary antibody for immunoblot |
Goat anti-rabbit IgG (HRP conjugated) antibody | abcam | cat#: ab6721, RRID: AB_955447 | Secondary antibody for immunoblot (lot#: GR3192725-5) |
Clarity Western ECL substrates | Bio-Rad | 1705060 | For immunoblot signal detection |
Amersham Imager 600 | GE Healthcare Life Sciences | 29083461 | For immunoblot signal detection |
ImageJ software | Freeware, NIH | – | For densitometry analysis |