Wij hebben vroeger een gouden nanoparticle peptide hybride intraveneus leveren een synthetische peptide, proteïne kinase C-delta Inhibitor van de omwenteling, die verminderd acute lung ischemie-reperfusie-veroorzaakte schade. Hier laten we het gedetailleerde protocol van de formulering van de drug. Andere intracellulaire peptiden kunnen ook worden geformuleerd.
Protein kinase C-delta remmer (PKCδi) is een veelbelovende drug ter voorkoming van ischemie-reperfusie-veroorzaakte orgel schade. Het is meestal geconjugeerd met een cel-penetrating peptide, TAT, voor intracellulair levering. TAT heeft echter aangetoond dat niet-specifieke biologische activiteit. Gouden nanodeeltjes (BNP) kan worden gebruikt als drug delivery dragers zonder erkende toxiciteit. Daarom hebben we een hybride GNP/peptide gebruikt voor PKCδi. Twee korte peptides (P2: CAAAAE en P4: CAAAAW), op een 95:5-verhouding, werden gebruikt voor het wijzigen van de oppervlakte-eigenschappen van het BNP. Geconjugeerd met PKCδi (GNP/PKCi) van het BNP zijn stabiel in gedistilleerd water, 0.9% NaCl, en -fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bevattende bovien serumalbumine of foetale runderserum. Intraveneuze injectie van GNP-PKCi werd eerder aangetoond dat het voorkomen van ischemie-reperfusie blessures van de longen. Dit artikel schetst een protocol voor het formuleren van GNP/PKCi en het beoordelen van de physiochemical eigenschappen van GNP/PKCi. We hebben soortgelijke methoden gebruikt voor het formuleren van andere drugs peptide gebaseerde met BNP. Dit artikel zal hopelijk meer aandacht vestigen op deze roman intracellulaire drug delivery technologie en haar toepassingen in vivo.
Longtransplantatie slaat patiënten met einde-fase Long ziekte1. Ernstige complicaties na longtransplantatie blijven echter een obstakel. In de vroege stadia na longtransplantatie, primaire graft disfunctie is de meest schadelijke complicatie1, en de primaire oorzaak is ischemie-reperfusie (IR)-geïnduceerde acute lung injury2.
Onder koude bewaring is stofwisseling in een donor Long beperkt tot een zeer laag niveau. Echter, reactieve zuurstof soorten en synthese van stikstofmonoxide worden geactiveerd als gevolg van de beëindiging van de bloed stroom3. Na de transplantatie, bloedcirculatie wordt hersteld, en reactieve zuurstof soorten en stikstofmonoxide gegenereerd tijdens koude ischemie verbeteren ontsteking en cel dood, wat resulteert in weefsel schade.
IR om letsel te voorkomen, is een proteïne kinase Cδ inhibitor (PKCδi) gebruikt in het hart, hersenen en longen4,5,6,7,8. Deze studies toonden aan dat PKCδi ontsteking en apoptosis tijdens reperfusie daalde. Het heeft ook verhinderd pulmonaire IR letsel bij ratten en in een Long transplantatie model6. PKCδi is meestal geconjugeerd met een cel-penetrating peptide, TAT, voor intracellulair levering. Het heeft echter aangetoond dat de TAT peptide alleen aspecifieke biologische effecten heeft, met inbegrip van de bevordering van de angiogenese, apoptosis en remming van meerdere cytokines9,10,11. Nanodeeltjes, kleine deeltjes, variërend van 1 tot 100 nm in diameter12, werden onderzocht als kandidaten bij het vergemakkelijken van de drug delivery13. Gouden nanodeeltjes (BNP) worden met name beschouwd als noninvasive en niet giftig. Daarom hebben wij van het BNP als drug delivery dragers voor peptide gebaseerde drugs14,15ontwikkeld.
Het oppervlak van het BNP kan gemanipuleerd worden voor specifieke toepassingen zoals moleculaire erkenning16,17, chemische sensing18, imaging19en drug delivery. Een GNP/peptide hybridesysteem heeft ontwikkeld, met 20 nm BNP en twee korte peptides (P2: CAAAAE en P4: CAAAAW) op een 95:5-verhouding, wijzigen van de oppervlakte-eigenschappen van het BNP. De P2-peptide, met de negatief geladen glutaminezuur (E) aan het eind, stabiliseert het BNP in een waterige oplossing, en de P4-peptide, met de hydrofobe tryptofaan (W) aan het eind, helpt het BNP ingang in cellen14. Het residu van cysteïne (C) in het N-terminus van deze peptides bevat een thiol-groep die tot en met de gouden oppervlakken14 conjugaat kan. Deze hybride peptide/BBP werd verder gebruikt voor het leveren van PKCδi (CSFNSYELGSL). De geoptimaliseerde molaire verhouding van P2:P4 naar PKCδi is 47.5:2.5:50. BNP geconjugeerd met PKCδi (GNP/PKCi) zijn stabiele in gedistilleerd water, 0.9% NaCl en PBS met boviene albumine of foetale runderserum14. Intraveneuze injectie van GNP/PKCi heeft aangetoond dat het voorkomen van ischemie-reperfusie blessures van de Long-15. Dit artikel beschrijft een methode om te formuleren GNP/PKCi en wordt beschreven hoe om te evalueren van de fysisch-chemische eigenschappen van de GNP/PKCi. We hebben soortgelijke methoden gebruikt voor het formuleren van andere peptide gebaseerde drugs geconjugeerd met GNP20,21,22. Hopelijk dat dit artikel zal meer aandacht vestigen op deze nieuwe formulering voor intracellulaire drug delivery.
Om ervoor te zorgen de juiste formulering, is het van cruciaal belang dat de oplossing van de δPKCi het ultrasoonapparaat stap beschreven in 1.6 ondergaat. ΔPKCi peptide reeks bevat hydrofobe wordt, dus een ultrasoonapparaat helpt bij het oplossen van PKCi in de oplossing van 50% acetonitril. Bovendien is het zeer belangrijk te mengen het oplosmiddel minutieus, zoals beschreven in stap 2.7. De GNP/PKCi hybrid zal niet goed worden geformuleerd indien deze stappen zijn niet behoorlijk gedaan, als gevolg van de samenvoe…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk wordt ondersteund door onderzoekssubsidies uit de Canadese instituten van het gezondheidsonderzoek (PJT-148847), ministerie van onderzoek en innovatie van Ontario (RE-08-029) en Canada eerste onderzoek of Excellence Program, geneeskunde door Design aan de Universiteit van Toronto. Dr. Mingyao Liu is James en Mary Davie Chair in Long letsel, reparatie en regeneratie.
negatively charged glutamic acid peptide (P2) | CanPeptide | Sequence: CAAAAE-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
hydrophobic tryptophan peptide (P4) | CanPeptide | Sequence: CAAAAW-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
δPKCi peptide | CanPeptide | Seqeuence: CSFNSYELGSL-NH2 Length: 11aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
Conical tube(50ml) | Corning Life Sciences | 3582070 | |
Conical tube(15ml) | Corning Life Sciences | 3582096 | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-100ML | |
Sonicator | Branson Ultrasonics Corp. | Branson 2510MTH | |
Microtube | Diamed.ca | AD 150-N | |
Gold nanoparticle solution | Ted Pella | 15705-5 | A particle size is 20nm |
Rocking Platform shaker | VWR international | 40000-304 | |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
Acryl cuvette | SARSREDT | 67.758 | |
UV-Vis spectrophotometer | Agilent | Caty 60 UV-Vis |