تأثير البروتينات الفلورية على الشركاء الانصهار باستخدام فحوصات السمية Polyglutamine في الخميرة
Summary
توضح هذه المقالة بروتوكولات لتقييم تأثير البروتينات الفلورية في تجميع والسمية لتوسيع polyglutamine تجمعات للتقييم السريع لبروتين فلوري أونتشاراكتيريزيد حديثا في السياق الصحفيين الفلورسنت.
Abstract
للتحقيق في التعريب البروتين والاتجار باستخدام imaging خلية حية، الباحثين غالباً ما تعتمد على الصمامات على بروتين الفائدة لمراسل فلورسنت. المتطورة باستمرار قائمة البروتينات الفلورية المشفرة جينياً (FPs) يوفر للمستخدمين مع عدة بدائل عندما يتعلق الأمر بتصميم الفلورسنت الانصهار. وقد كل FP الخصائص البصرية والفيزيائية الحيوية التي يمكن أن تؤثر في الخصائص البيوكيميائية والخلوية، والوظيفية للانشطار الفلورسنت الناتجة عن ذلك. على سبيل المثال، تميل FPs عدة شكل غير محدد ليغومرات التي عرضه لإعاقة وظيفة الشريك الانصهار. لسوء الحظ، توجد سوى عدد قليل من الطرق لاختبار تأثير FPs على سلوك المراسل الفلورسنت. هنا، يمكننا وصف أسلوب بسيط يتيح للتقييم السريع لتأثير إطارا في الثانية باستخدام فحوصات السمية بوليجلوتاميني (polyQ) في مهدها الخميرة Saccharomyces cerevisiae. البروتينات هونتينجتين PolyQ–الموسع ترتبط بظهور مرض هنتنغتون (HD)، حيث تجمع هونتينجتين الموسعة ليغومرات السامة وإدراج الهيئات. التجميع وسمية polyQ التوسعات في الخميرة تعتمد اعتماداً كبيرا على تسلسلات المرافقة منطقة polyQ، بما في ذلك وجود العلامات الفلورسنت، مما يوفر منصة تجريبية مثالية لدراسة تأثير FPs على السلوك بهم شريك الانصهار.
Introduction
حيث تم وضع توصيف الأولية من البروتين الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) من فيكتوريا أيقووريا1، لوحة واسعة من FPs وراثيا المرمزة، يسمح علماء الأحياء الخلية تعريب وتتبع في الوقت نفسه متعددة الأحداث/البروتينات الخلوية في معيشة الخلايا2،3. FPs مشتقة من كائنات متعددة، من قنديل البحر للمرجان، ومن ثم عرض الخصائص الفيزيائية الحيوية محددة تحول على نطاق واسع خارج الطيف الفلورسنت كل منها على. وتشمل هذه الخصائص السطوع، فوتوستابيليتي، وميل إلى أوليجوميريزي بين الآخرين2،4. تحديد أحادي FPs جانبا مهما في اختيار علامة مناسبة عند تصميم مراسل فلورسنت، بغية تقليل التفاعلات غير مناسب وتعديلات مهمة الشريك الانصهار وتعظيم كفاءة مراسل ونظرا لحجرة الخلوية4،،من56. في حين قد تطور التجارة والنقل، على مر الزمن، لتقليل تأثير إضافة علامة مضيئة للانصهار شريك5،،من78، كيفية أداء المتغيرات FP الجديدة بالمقارنة مع التجارة والنقل لا يزال من الصعب تقييم.
توجد أساليب عدة لوصف سلوك FPs. معظمها تتضمن اختبار الخصائص الفيزيائية الأحيائية إطارا في الثانية باستخدام الطرق الكيميائية الحيوية، مثل تنبيذ فائق وهلام الترشيح البروتوكولات9،10،،من1112. مثل هذه الأساليب والتحذير من استخدام FPs المنقاة في الحل، توفر القليل من التبصر في سلوكهم في خلايا سليمة. تطوير عروض المقايسة هيولى السلس المنظم (عسر) بتقييم قابلة للقياس الكمي للميل في الثانية إلى أوليجوميريزي في المعيشة الخلايا13 عن طريق اختبار قدرة overexpressed في الثانية لإعادة تنظيم الأنابيب هيولى في عسر جدلات14. هذا الأسلوب بنجاح الكشف عن التغييرات بين المتغيرات موحودي وأوليجوميريك للتجارة والنقل وغيرها في الثانية. ومع ذلك، يعتمد معظمها على أوفيريكسبريسيون في خلايا transfected عابر، وكوانتيتاتيون، وتحليل الصور يمكن أن يستغرق وقتاً طويلاً ما لم يتم اعتماد التقنية كجمع البيانات آليا وتحليل سير العمل.
من أجل استكمال هذه النهج، أنشأنا فحص أن يستفيد من تأثير العلامات الفلورية في سمية والتجميع للتوسعات polyQ في الخميرة15،16. ويكرر التوسع في امتداد polyQ مع أكثر من 36 داخل إكسون أول من ترميز الجينات البروتين هونتينجتين (Htt) يرتبط بمرض هنتنغتون17،18. التعبير عن توسيع Httex1 في نتائج الخميرة في تجميعاً قوية من البروتين Htt تجمعات بالإضافة إلى خلل نمو حاد. من المثير للاهتمام، تتأثر بشدة هذه تعمل تسلسل المرافقة على امتداد polyQ، بما في ذلك15،في الثانية16. أنه تم ترشيد أن خصائص مختلفة من FPs خلطات يمكن أن تؤثر على polyQ سمية في الخميرة. وفي الواقع، بالمقارنة مع قوة حماية المنشآت مثل التجارة والنقل، بروتينات الفلورسنت الأحمر وأشكالها تطورت أظهرت انخفاض السمية والتراكم16. وتوفر هذه المخطوطة بروتوكول مفصلة لتقييم الأثر للجيل القادم من قوة حماية المنشآت في polyQ السمية والتراكم في الخميرة. يسمح هذا الفحص لتحليل السريع ويحتمل أن تكون عالية المحتوى FP المتغيرات التي يمكن استخدامها بالتوازي مع سبق تتميز تقنيات لتوصيف الأمثل من جديد في الثانية ويمكن تقييم كيف تؤدي مقارنة بالتجارة والنقل.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المقالة، كانوا يعملون فحوصات مختلفة لقياس تجميع Httex1 polyQ التوسعات وأثرها على نمو الخميرة كنموذج لدراسة الفلورسنت كيف مختلف البروتينات تغيير شركائها الانصهار في سياق الصحفيين نيون . استخدام متغير التجارة والنقل (يمسفجفب) كعنصر إيجابي، واظهرنا أن هذا الكشف عن تغييرات كبيرة في po…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذه الدراسة يدعمه منحة تشغيلية من “المعاهد الكندية” “البحوث الصحية” M.L.D. ول الأعمال المعروضة هنا معتمد من قبل على جائزة “جون ر. إيفانز رئيس الصندوق” من “المؤسسة الكندية” للابتكار ومعتمد كتمويل من “صندوق البحوث أونتاريو” إلى Y.J. بدرجة ماجستير لمنحه الدكتوراه نقل من عميد كلية Schulich ل M اديسيني وطب الأسنان في جامعة أونتاريو الغربية. S.D.G. تدعمه “منحة الدكتوراه” من كندا المرض.
Materials
| 5-alpha Competent E. coli (High efficiency) | New Englanfd Biolab | C2987 | |
| SpeI-HF | New Englanfd Biolab | R3133 | High fidelity enzymes are preferred |
| SalI-HF | New Englanfd Biolab | R0138 | High fidelity enzymes are preferred |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160 | |
| LB-Agar | Fisher Scientific | BP1425 | |
| LB-Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Ampicilin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600382 | |
| EPOCH2 microplate spectrophotometer | BioTek Instruments inc | EPOCH2TC | |
| Yeast Pin Replicator | V&P Scientific inc. | VP407AH | |
| SPI imager | S&P Robotics inc. | spImager-M | |
| Zeiss LSM 800 confocal with AryScan | Carl Zeiss Microscopy | LSM 800 | |
| 8 well Lab-Tek imaging chambers | Fisher Scientific | 12565470 | |
| Bio-Dot apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Chemi Doc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| anti-FLAG M1 antibody | Sigma-Aldrich | F3040 | |
| Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody | Thermo | A32727 | |
| Plasmid MiniPrep Kit | Fisher Scientific | K0503 | |
| Plasmid Gel extraction Kit | Fisher Scientific | K0831 | |
| PCR Purification Kit | Fisher Scientific | K0702 | |
| Prizm | GraphPad | N/A | |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Fisher Scientific | BP13354 |
References
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
- Shcherbakova, D. M., Subach, O. M., Verkhusha, V. V. Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design. Angewandte Chemie. 51 (43), 10724-10738 (2012).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist’s user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nature Communications. 6, 7670 (2015).
- Costantini, L. M., Snapp, E. L. Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions. DNA and Cell Biology. 32 (11), 622-627 (2013).
- Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. The molecular structure of green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Pédelacq, J. -. D., et al. Engineering soluble proteins for structural genomics. Nature Biotechnology. 20 (9), 927-932 (2002).
- Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 11984-11989 (2000).
- Laue, T. M., Stafford, W. F. Modern applications of analytical ultracentrifugation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 75-100 (1999).
- Pédelacq, J. -. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2006).
- Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).
- Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. The Journal of Cell Biology. 163 (2), 257-269 (2003).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11045-11050 (2006).
- Jiang, Y., Di Gregorio, S. E., Duennwald, M. L., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity in yeast uncovers phenotypic variations between different fluorescent protein fusions. Traffic. 18 (1), 58-70 (2017).
- Penney, J. B., Vonsattel, J. P., MacDonald, M. E., Gusella, J. F., Myers, R. H. CAG repeat number governs the development rate of pathology in Huntington’s disease. Annals of Neurology. 41 (5), 689-692 (1997).
- Gusella, J. F., MacDonald, M. E. Huntington’s disease: seeing the pathogenic process through a genetic lens. Trends in Biochemical Sciences. 31 (9), 533-540 (2006).
- Albakri, M. B., Jiang, Y., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity assays highlight the advantages of mScarlet for imaging in Saccharomyces cerevisiae [version 1; referees: 1 approved, 1 approved with reservations]. F1000Research. 7, 1242 (2018).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).
- Duennwald, M. L. Yeast as a platform to explore polyglutamine toxicity and aggregation. Methods in Molecular Biology. 1017, 153-161 (2013).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11051-11056 (2006).
- Lee, S., Lim, W. A., Thorn, K. S. Improved blue, green, and red fluorescent protein tagging vectors for S. cerevisiae. Plos One. 8 (7), e67902 (2013).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. (17), e838 (2008).
- Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. 유전학. 122 (1), 19-27 (1989).
- Thomas, B. J., Rothstein, R. Elevated recombination rates in transcriptionally active DNA. Cell. 56 (4), 619-630 (1989).
- Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).
- Meriin, A. B., et al. toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1. The Journal of Cell Biology. 157 (6), 997-1004 (2002).
- Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156 (1), 119-122 (1995).
- Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
- Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
