Effetto di proteine fluorescenti su Fusion partner utilizzando saggi di tossicità di Polyglutamine in lievito
Summary
Questo articolo descrive i protocolli per valutare l’effetto di proteine fluorescenti sull’aggregazione e la tossicità di polyglutamine misfolded espansione per la valutazione rapida di una proteina fluorescente appena atipico nel contesto del reporter fluorescenti.
Abstract
Per l’indagine di localizzazione della proteina e il traffico usando la formazione immagine di cellule vive, i ricercatori spesso si affidano loro proteina di interesse ad un reporter fluorescente di fusione. L’elenco in continua evoluzione delle proteine fluorescenti geneticamente codificate (FPs) presenta agli utenti con diverse alternative quando si tratta di design fusion fluorescente. Ogni FP ha specifiche proprietà ottiche e biofisiche che possono influenzare le proprietà biochimiche, cellulari e funzionali delle fusioni fluorescente risultante. Per esempio, parecchi FPs tendono a formare oligomeri non specifici che sono suscettibili di ostacolare la funzione del partner di fusione. Purtroppo, solo pochi metodi esistono per testare l’impatto di FPs sul comportamento del reporter fluorescente. Qui, descriviamo un metodo semplice che permette la rapida valutazione dell’impatto della FPs utilizzando poliglutammina (polyQ) saggi di tossicità nel lievito Saccharomyces cerevisiae. Proteine di huntingtin PolyQ espanso sono associati con l’insorgenza della malattia di Huntington (HD), dove l’huntingtina espanso vengono aggregati in oligomeri tossici e corpi di inclusione. L’aggregazione e la tossicità di poliQ espansioni in lievito sono altamente dipendente sulle sequenze fiancheggianti la regione di poliQ, compresa la presenza di tag fluorescente, fornendo così una piattaforma sperimentale ideale per studiare l’impatto di FPs sul comportamento dei loro partner di fusione.
Introduction
Poiché la caratterizzazione iniziale della proteina fluorescente verde (GFP) da Aequorea victoria1, un’ampia tavolozza di FPs codificato geneticamente sono stati sviluppati, permettendo i biologi delle cellule localizzare e monitorare contemporaneamente più eventi/proteine cellulari in vita cellule2,3. FPs sono derivati da organismi multipli, da meduse di corallo e pertanto, visualizzazione specifiche proprietà biofisiche che deviare ampiamente di là di loro rispettivo spettro fluorescente. Queste proprietà includono luminosità, fotostabilità e una tendenza a oligomerizzazione tra gli altri2,4. Selezionando monomerico FPs è un aspetto importante nella selezione di un tag adatto quando si progetta un reporter fluorescente, per minimizzare interazioni inappropriati e alterazioni della funzione del partner di fusione e massimizzare l’efficienza di reporter per un dato il compartimento cellulare4,5,6. Mentre GFP è, nel tempo, stato evoluto per ridurre al minimo l’effetto di aggiungere il tag fluorescente per la fusion partner5,7,8, come nuove varianti di FP eseguire rispetto a GFP rimane difficile da valutare.
Esistono alcuni metodi per caratterizzare il comportamento di FPs. La maggior parte di essi coinvolgono test proprietà biofisiche di FPs utilizzando approcci biochimici, quali ultracentrifugazione e gel filtrazione protocolli9,10,11,12. Tali metodi hanno l’avvertenza di utilizzare purificata FPs in soluzione, offrendo una visione poco sul loro comportamento in cellule intatte. Lo sviluppo delle offerte saggio organizzato reticolo endoplasmatico liscio (OSER) una valutazione quantificabile di tendenza FPs’ a oligomerizzazione in vita cellule13 testando la capacità di riorganizzare i tubuli di reticolo endoplasmatico in FPs iperespresso OSER verticilli14. Questa tecnica è in grado di rilevare correttamente le modifiche tra le varianti monomerici e oligomerici di GFP e altri FPs. Tuttavia, esso si basa principalmente sulla sovraespressione in cellule trasfettate transitoriamente e la quantificazione e l’analisi di immagine può richiedere molto tempo, a meno che la tecnica viene adottata come una raccolta automatizzata dei dati e del flusso di lavoro di analisi.
Al fine di integrare questi approcci, abbiamo stabilito un’analisi che sfrutta l’effetto fluorescente tag sulla tossicità e aggregazione di poliQ espansioni in lievito15,16. L’espansione del tratto poliQ con più di 36 ripetizioni all’interno il primo essone del gene codificante che la proteina huntingtina (Htt) è associata con la malattia di Huntington17,18. L’espressione di espanso Httex1 nei risultati di lievito in una forte aggregazione delle proteine misfolded Htt accoppiata ad un difetto di sviluppo severo. Interessante, questi fenotipi sono fortemente influenzati dalle sequenze fiancheggianti il tratto poliQ, tra cui FPs15,16. Esso è stato razionalizzato che le diverse proprietà di FPs differenzialmente possono influenzare la tossicità polyQ in lievito. Infatti, rispetto alla GFP-come FPs, proteine fluorescenti rosse e le loro forme evolute hanno mostrato una ridotta tossicità e aggregazione16. Questo manoscritto fornisce un protocollo dettagliato per valutare l’effetto della prossima generazione di FPs sulla tossicità di poliQ e aggregazione in lievito. Questo test consente un’analisi rapida e potenzialmente ad alto contenuto di varianti FP che può essere utilizzato in parallelo con precedentemente caratterizzato tecniche per la caratterizzazione ottima del nuovo FPs e può valutare come se la cavano rispetto a GFP.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo articolo, vari metodi per misurare l’aggregazione di Httex1 polyQ espansioni e loro effetto sulla crescita del lievito sono stati impiegati come un modello per studiare come i diversi fluorescente proteine alterano i loro soci di fusione nel contesto del reporter fluorescenti . Usando una variante GFP (ymsfGFP) come controllo positivo, abbiamo mostrato che questo rileva cambiamenti significativi nella tossicità di poliQ e aggregazione tra i diversi tag fluorescente e consente un confronto diretto e …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è supportato da una sovvenzione di funzionamento da istituti canadesi per ricerca di salute M.L.D e P.L. Il lavoro qui presentato è supportato da un John R. Evans Leader Fund award della Fondazione canadese per l’innovazione e un corrispondente fondo del fondo di ricerca di Ontario per P.L. Y.J. è supportato da un master alla borsa di studio di dottorato trasferimento dal preside della scuola Schulich di M edicine e odontoiatria presso l’Università del Western Ontario. S è supportato da una borsa di studio di dottorato di ricerca in Canada ALS.
Materials
| 5-alpha Competent E. coli (High efficiency) | New Englanfd Biolab | C2987 | |
| SpeI-HF | New Englanfd Biolab | R3133 | High fidelity enzymes are preferred |
| SalI-HF | New Englanfd Biolab | R0138 | High fidelity enzymes are preferred |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160 | |
| LB-Agar | Fisher Scientific | BP1425 | |
| LB-Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Ampicilin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600382 | |
| EPOCH2 microplate spectrophotometer | BioTek Instruments inc | EPOCH2TC | |
| Yeast Pin Replicator | V&P Scientific inc. | VP407AH | |
| SPI imager | S&P Robotics inc. | spImager-M | |
| Zeiss LSM 800 confocal with AryScan | Carl Zeiss Microscopy | LSM 800 | |
| 8 well Lab-Tek imaging chambers | Fisher Scientific | 12565470 | |
| Bio-Dot apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Chemi Doc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| anti-FLAG M1 antibody | Sigma-Aldrich | F3040 | |
| Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody | Thermo | A32727 | |
| Plasmid MiniPrep Kit | Fisher Scientific | K0503 | |
| Plasmid Gel extraction Kit | Fisher Scientific | K0831 | |
| PCR Purification Kit | Fisher Scientific | K0702 | |
| Prizm | GraphPad | N/A | |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Fisher Scientific | BP13354 |
References
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