효 모에 Polyglutamine 독성 분석 실험을 사용 하 여 퓨전 파트너에 형광 단백질의 영향
Summary
이 문서에서는 집계에 형광 단백질의 효과 형광 기자 들의 맥락에서 새로 새롭거나 형광 단백질의 급속 한 평가 misfolded polyglutamine 확장의 독성을 평가 하기 위해 프로토콜을 설명 합니다.
Abstract
단백질 지 방화 및 라이브 셀 이미징 사용 하 여 매매의 수사에 대 한 연구는 종종 형광 기자에 게 관심사의 그들의 단백질을 융합에 의존 합니다. 끊임없이 진화 목록이 유전자 인코딩된 형광 성 단백질 (FPs) 형광 퓨전 디자인에 관해서 여러 대안을 가진 사용자를 선물 한다. 각 FP는 특정 광학 및 생물 속성이 결과 형광 융해의 생화학, 세포, 및 기능 속성에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, 여러 FPs 융합 파트너의 기능에 방해에 취약 일반 올리고를 형성 하는 경향이 있다. 불행히도, 몇 가지 방법만 형광 기자의 행동에 FPs의 영향을 테스트 위해 존재 합니다. 여기, polyglutamine (polyQ) 독성 분석 실험을 사용 하 여 신진 효 모 Saccharomyces cerevisiae에 FPs의 영향의 급속 한 평가 가능 하 게 간단한 방법을 설명 합니다. PolyQ 확장 huntingtin 단백질 확장된 huntingtin 독성 올리고 포함 시체로 집계 Huntington의 질병 (HD)의 증상과 연결 됩니다. 집계 및 효 모에 polyQ 확장의 독성은 높은 FPs의 행동에 미치는 영향을 공부 하는 이상적인 실험 플랫폼을 제공 하는 형광 태그의 존재를 포함 하 여 polyQ 지역 측면 시퀀스에 따라 그들의 퓨전 파트너입니다.
Introduction
이후 Aequorea 빅토리아1, 유전자 인코딩된 FPs의 넓은 팔레트에서에서 녹색 형광 단백질 (GFP)의 초기 특성을 개발 하 고, 허용 동시에 지역화 및 추적 세포 생물학 여러 생활에서 셀룰러 이벤트/단백질 세포2,3. FPs는 산호, 그리고 그러므로, 표시 특정 생물 속성을 광범위 하 게 그들의 각각 형광 스펙트럼 넘어 전환에 해파리에서 여러 유기 체에서 파생 됩니다. 이러한 속성에는 밝기, photostability, 및 다른 사람의 사이에서 oligomerize2,4경향이 포함 됩니다. 부적절 한 상호 작용 및 융합 파트너의 기능 변경 최소화 하 고 대 한 기자 효율 극대화 형광 기자를 설계할 때 적합 한 태그의 선택에 중요 한 측면 이다 단위체 FPs를 선택 하는 주어진 세포 구획4,,56. GFP는, 시간이 지남에 진화 되었습니다 융합 파트너5,,78형광 태그를 추가 하는 효과 최소화 하기 위해 하는 동안 GFP 남아 평가 하기 어려운 새로운 FP의 변종에 비해 수행 하는 방법.
FPs의 동작에 몇 가지 방법이 존재 한다. 그들의 대부분 ultracentrifugation 같은 생 화 확 적인 방법을 사용 하 여 프레임의 생물 속성 테스트를 포함 하 고 젤 여과 프로토콜9,10,,1112. 이러한 메서드는 그대로 셀에 그들의 행동에 약간의 통찰력을 제공 하는 솔루션에서 순화 된 프레임을 사용 하 여 경고. 조직된 부드러운 바인딩과 그물 (OSER) 분석 결과 제공의 개발 FPs’ 경향이 생활에서 oligomerize의 정량 평가에 떠다니고 그물 tubules를 재구성 overexpressed FPs의 능력을 테스트 하 여13 세포 OSER whorls14. 이 기술을 성공적으로 GFP의 단위체 및 oligomeric 변형 및 다른 프레임 간의 변화를 감지할 수 있습니다. 그러나, overexpression 뚜렷이 transfected 세포에 주로 의존 하 고 정량 및 이미지 분석 시간이 걸릴 수 기술을 자동화 된 데이터 수집 및 분석 워크플로우로 채택 하지 않는 한.
이러한 접근을 보완 하기 위해 효 모15,16에서 독성에 형광 태그의 효과 및 polyQ 확장의 집계의 이용 하는 분석 결과 설립 했습니다. 이상 36와 polyQ 스트레치의 확장 huntingtin 단백질 (Htt)이 헌팅턴 병17,18연관 유전자 인코딩 첫 번째 엑손에서 반복 됩니다. 가혹한 성장 결함을 결합 misfolded Htt 단백질의 강한 집계에 효 모 결과에 확장된 Htte x 1 의 식입니다. 흥미롭게도,이 고기 FPs15,16를 포함 하 여 polyQ 스트레치 측면 시퀀스에 의해 강하게 좌우 된다. 그것은 프레임의 다른 속성 polyQ 독성 누 룩에 영향을 미칠 차동 수 합리화 했다. 실제로, GFP 같은 FPs에 비해 붉은 형광 단백질 및 그들의 진화 형태 나타났습니다 감소 독성 및 집계16. 이 원고는 polyQ 독성과 효 모에 집계에 FPs의 다음 세대의 효과 평가 하기 위해 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 이 분석 결과 이전 특징을 동시에 사용할 수 있는 FP의 변종의 신속 하 고 잠재적으로 하이 콘텐츠 분석에 대 한 새로운 FPs 고 수의 최적의 특성에 대 한 기술 평가 어떻게 그들이 수행 GFP에 비해 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 문서에서는, Httex1 polyQ 확장 및 효 모 성장에 미치는 영향의 집계를 측정 하기 위해 다양 한 분석 공부 어떻게 다른 형광 모델로 채택 되었다 단백질 형광 기자 들의 맥락에서 그들의 퓨전 파트너 변경 . 우리이 polyQ 독성 및 집계 다른 형광 태그 사이 상당한 변화를 감지 하 고 polyQ FP 퓨전 성능에 대 한 직접적이 고 빠른 비교에 대 한 수 보여 긍정적인 컨트롤로 GFP 변형 (ymsfGFP)를 사용 하 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구 M.L.D.와 P.L. 건강 연구를 위한 캐나다 학회에서 운영 보조금에 의해 지원 됩니다. 여기에 제시 된 작품은 존 R. 에반스 지도자 기금 수상 혁신을 위한 캐나다 재단에서 지원 하 고 P.L. Y.J.에 온타리오 연구 기금에서 매칭 펀드 Schulich M 학교 학장에서 박사 전송 하는 MSc에 의해 지원 됩니다. edicine 고 치과에 웨스턴 온타리오 대학. S.D.G.는 ALS 캐나다에서 박사 학위 장학금에 의해 지원 됩니다.
Materials
| 5-alpha Competent E. coli (High efficiency) | New Englanfd Biolab | C2987 | |
| SpeI-HF | New Englanfd Biolab | R3133 | High fidelity enzymes are preferred |
| SalI-HF | New Englanfd Biolab | R0138 | High fidelity enzymes are preferred |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160 | |
| LB-Agar | Fisher Scientific | BP1425 | |
| LB-Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Ampicilin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600382 | |
| EPOCH2 microplate spectrophotometer | BioTek Instruments inc | EPOCH2TC | |
| Yeast Pin Replicator | V&P Scientific inc. | VP407AH | |
| SPI imager | S&P Robotics inc. | spImager-M | |
| Zeiss LSM 800 confocal with AryScan | Carl Zeiss Microscopy | LSM 800 | |
| 8 well Lab-Tek imaging chambers | Fisher Scientific | 12565470 | |
| Bio-Dot apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Chemi Doc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| anti-FLAG M1 antibody | Sigma-Aldrich | F3040 | |
| Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody | Thermo | A32727 | |
| Plasmid MiniPrep Kit | Fisher Scientific | K0503 | |
| Plasmid Gel extraction Kit | Fisher Scientific | K0831 | |
| PCR Purification Kit | Fisher Scientific | K0702 | |
| Prizm | GraphPad | N/A | |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Fisher Scientific | BP13354 |
References
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