Summary
यहां, हम एक प्रोटोकॉल मौजूद माउस का आकलन करने के लिए पेरिटोनियल मैक्रोफेज phagocytosis का उपयोग कर बढ़ाया ग्रीन प्रतिदीप्ति प्रोटीन-व्यक्त ई कोलाई।
Abstract
इस पांडुलिपि एक सरल और reproducible विधि का वर्णन करने के लिए एक phagocytosis परख प्रदर्शन । इस विधि के पहले भाग में एक पालतू-सूमो-EGFP वेक्टर (सूमो = छोटे ubiquitin-जैसे संशोधक) का निर्माण और ई कोलाई (BL21DE) में संवर्धित हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन (EGFP) व्यक्त करना शामिल है । EGFP-व्यक्त ई. कोलाई ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए मैक्रोफेज के साथ coincubated है; नकारात्मक नियंत्रण समूह बर्फ पर समय की एक ही राशि के लिए मशीन है । फिर, मैक्रोफेज आकलन के लिए तैयार हैं । इस तकनीक के फायदों में इसके सरल और सीधा कदम शामिल हैं, और phagocytosis को दोनों फ्लो cytometer और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप से मापा जा सकता है । EGFP-व्यक्त ई. कोलाई स्थिर है और एक मजबूत प्रतिदीप्ति संकेत प्रदर्शन के बाद भी मैक्रोफेज paraformaldehyde के साथ तय कर रहे हैं । यह विधि न केवल मैक्रोफेज सेल लाइनों या इन विट्रो में प्राथमिक मैक्रोफेज के आकलन के लिए उपयुक्त है बल्कि परिधीय रक्त phagocytosis कोशिकाओं में granulocyte और monocyte mononuclear के मूल्यांकन के लिए भी उपयुक्त है । परिणाम बताते हैं कि युवा (आठ सप्ताहीय) चूहों से पेरिटोनियल मैक्रोफेज की phagocytic क्षमता वृद्ध (१६ माह की उम्र वाले) चूहों से मैक्रोफेज की तुलना में अधिक है. संक्षेप में, इस विधि मैक्रोफेज phagocytosis उपायों और सहज प्रतिरक्षा प्रणाली समारोह का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है ।
Introduction
मैक्रोफेज phagocytosis परख अक्सर जन्मजात प्रतिरक्षा समारोह का अध्ययन किया जाता है । जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया संक्रमण के लिए संवेदनशीलता का संकेत हो सकता है । मैक्रोफेज सेल लाइनों इम्यूनोलॉजी अध्ययन में व्यापक रूप से प्रयोग किया जाता है । हालांकि, विस्तारित पारित होने के कारण जीन हानि और समझौता प्रतिरक्षा कार्य इन सेल लाइनों में हो सकता है । इस प्रकार, प्राथमिक पेरिटोनियल मैक्रोफेज आदर्श वस्तु है जिसमें सेल समारोह1का अध्ययन करने के लिए कर रहे हैं ।
हालांकि जंमजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए वृद्ध शरीर में बरकरार सोचा था, phagocytic क्षमता कम हो सकती है कि छोटे शरीर2,3में की तुलना में । यहां, हम युवा (आठ से पेरिटोनियल मैक्रोफेज के phagocytosis का आकलन करने के लिए एक विधि का प्रदर्शन करेंगे सप्ताह पुराने) और आयु वर्ग (16 महीने पुराने) माउस का उपयोग EGFP-व्यक्त ई. कोलाई, जो सुविधाजनक, जल्दी है, और आर्थिक रूप से संभव है ।
एक EGFP-व्यक्त ई. कोलाई तनाव का उपयोग इस परख के लाभों में से एक है क्योंकि इन बैक्टीरिया स्थिर है और एक मजबूत प्रतिदीप्ति संकेत प्रदर्शित कर रहे हैं, के बाद भी मैक्रोफेज द्वारा तय कर रहे है 4% (w/ इसके अतिरिक्त, EGFP-व्यक्त ई. कोलाईका उपयोग करके, शोधकर्ताओं आगे phagocytosis, जो समय बचाता है के बाद दाग की जरूरत नहीं है । इसके अलावा, मैक्रोफेज ई. कोलाई सतह प्रतिजन के लिए immunoresponsive रहे हैं, ई. कोलाई अधिक phagocytosis परख के लिए EGFP-व्यक्त कवक या fluorescein-लेबल मोतियों का उपयोग करने से उपयुक्त बना ।
साथ EGFP-व्यक्त ई. कोलाई, एक phagocytosis परख आसानी से 2 ज में पूरा किया जा सकता है और दोनों प्रवाह cytometry और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा मापा, शोधकर्ता के उद्देश्य पर निर्भर करता है । चूंकि यह विधि सीधे phagocytic की क्षमता का उपाय है, परिणाम अंय अप्रत्यक्ष तरीकों की तुलना में अधिक reproducible हैं ।
यह विधि एक कच्ची 264.7 सेल लाइन और मानव परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं4में भी मान्य किया गया है । नीचे दिए गए पाठ इस परख प्रदर्शन के लिए विस्तृत कदम दर कदम निर्देश प्रदान करता है और महत्वपूर्ण कदम है कि शोधकर्ताओं को अपने प्रयोगों की जरूरतों को पूरा संशोधित कर सकते है पर प्रकाश डाला गया ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
सभी प्रक्रियाओं की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए स्वास्थ्य के दिशा निर्देशों के राष्ट्रीय संस्थानों के तहत प्रदर्शन किया गया, और प्रोटोकॉल पशु देखभाल और डालियां चिकित्सा विश्वविद्यालय के उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया । सोलह महीने की उम्र (30-35 ग्राम के एक शरीर के वजन के साथ) और आठ सप्ताह की उम्र (20-25 ग्राम) spf (विशिष्ट-रोगज़नक़-मुक्त) पुरुष C57BL/6 चूहे डालियां मेडिकल यूनिवर्सिटी के SPF एनिमल सेंटर से प्राप्त किए गए. सभी चूहों भोजन और पानी विज्ञापन libitumके लिए उपयोग के साथ पशु आवास में रखा गया था । तापमान 20-24 ° c पर रखा गया था, आर्द्रता 40%-७०% थी, और प्रकाश 12 ज प्रकाश/ प्रयोग करने से पहले जानवरों को acclimate करने की अनुमति दी जाती थी ।
1. पीईटी-सुमो-EGFP प्लाज्मिड और EGFP अभिव्यक्ति की प्रेरण का निर्माण
- EGFP जीन टुकड़ा (एक ७१७ बीपी एक कस्टम जीन संश्लेषण सेवा द्वारा संश्लेषित अनुक्रम, सामग्री की तालिका देखें और अनुक्रम के लिए अनुपूरक फ़ाइल 1 ) को संश्लेषित और आगे प्राइमर के साथ टुकड़ा बढ़ाना ( 5 '-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3 ') और रिवर्स प्राइमर (5 '-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3 '), उच्च निष्ठा Taq डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग कर ।
- यह सुनिश्चित करने के लिए कि पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) उत्पादों को एकल 3 ' adenine अगले चरण में टा क्लोनिंग के लिए हैंग हो जाता है, पिछले चक्र के बाद ७२ ° c पर 30 मिनट के विस्तार का उपयोग करें (पीसीआर शर्तों के लिए अनुपूरक फाइल 1 देखें) । agarose जेल ट्रो द्वारा पीसीआर उत्पाद की जांच करें ।
- पालतू-सूमो वेक्टर में पीसीआर उत्पाद क्लोन ( सामग्री की तालिकादेखें) टी-4 डीएनए ligase के साथ टीए क्लोनिंग विधि5 का उपयोग कर । 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान (20-25 डिग्री सेल्सियस) पर प्रतिक्रिया की मशीन । वेक्टर न्यूक्लियोटाइड ६५३ और ६५४ के बीच एक 1 बीपी 5 ' टी के साथ रैखिक है प्रत्येक किनारा पर बदस्तूर ।
- इस प्रकार के रूप में रासायनिक सक्षम BL21 (de) ई. कोलाई तनाव में बंधाव उत्पाद रूपांतरण: 5 µ एल (पीसीआर उत्पाद के १०० एनजी) १०० µ एल के लिए BL21 (DE) गर्मी सदमे के माध्यम से सक्षम कोशिकाओं ९० s के लिए ४२ ° c पर जोड़ें; 3 मिनट के लिए बर्फ पर मिश्रण रखो, और फिर, lysogeny शोरबा (पौंड) मध्यम गरम ३७ ° c में ४०० µ एल जोड़ने के लिए, यह 1 ज के लिए ३७ ° c और १२० rpm पर मिलाते हुए ।
- Inoculate १०० एक पौंड की सतह पर बैक्टीरिया के µ एल-कनमीसिन (१०० µ g/एमएल) प्लेट उत्प्रेरण लैक्टोज के साथ (०.५ mmol/एल), EGFP अभिव्यक्ति तनाव उपज । रात भर ३७ डिग्री सेल्सियस पर थाली मशीन ।
नोट: यदि EGFP सफलतापूर्वक व्यक्त किया जाता है, कुछ कालोनियों अंधेरे में चमक हरी प्रकाश के रूप में मनाया जा सकता है ।- वैकल्पिक रूप से, डीएनए अनुक्रमण द्वारा डाला EGFP टुकड़ा सत्यापित करने के लिए कालोनियों का चयन करें । डीएनए अनुक्रमण के लिए प्राइमर हैं: फॉरवर्ड, 5 '-AGATTCTTGTACGACGGTATTAG-3 '; उलट, ५ '-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-३ '.
- Inoculate १०० µ जी/एमएल कनमीसिन के साथ पौंड मध्यम के 5 मिलीलीटर में एक सकारात्मक कॉलोनी । 2 घंटे के लिए १२० rpm पर एक ३७ ° c मिलाते में मशीन, और फिर, ०.५ mmol/एल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए उत्प्रेरण लैक्टोज जोड़ें और 6 एच के लिए हिला, EGFP अभिव्यक्ति उत्प्रेरण जारी है । Empirically, जब 6 एच के लिए मिलाते हुए, ६०० एनएम (OD600) पर ऑप्टिकल घनत्व ०.७ या उच्चतर तक पहुंच सकता है ।
- एक स्लाइड पर बैक्टीरियल संस्कृति माध्यम के 10 µ एल जोड़ें, यह एक coverslip के साथ कवर, और एक औंधा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत EGFP की अभिव्यक्ति की जांच । EGFP-व्यक्त बैक्टीरिया कई हफ्तों के लिए 2-8 डिग्री सेल्सियस पर मध्यम में संग्रहित किया जा सकता है ।
2. माउस पेरिटोनियल मैक्रोफेज अलगाव और प्राथमिक संस्कृति
- आसुत जल के १०० मिलीलीटर के लिए thioglycolate के ३.५ ग्राम जोड़ें और उपयोग करने से पहले मिश्रण को बाँझ आटोक्लेव । माउस पेरिटोनियल इंजेक्शन के लिए हुड में 1 मिलीलीटर बाँझ सिरिंज में thioglycolate माध्यम पंप । संक्रमण से बचने के लिए सिरिंज प्रति एक माउस का प्रयोग करें । thioglycolate के प्रयोग से मैक्रोफेज की संख्या बढ़ सकती है । निवासी पेरिटोनियल मैक्रोफेज thioglycolate के बिना, लेकिन कम मैक्रोफेज पैदावार के साथ अलग किया जा सकता है ।
- एक स्थानीय पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित विधि का उपयोग माउस Anesthetize । 1 मिलीलीटर सिरिंज के साथ माउस पेरिटोनियल गुहा में ३.५% thioglycolate माध्यम के 1 मिलीलीटर सुई, एक 23 जी की सुइयों का उपयोग कर.
नोट: संज्ञाहरण उत्प्रेरण द्वारा, पेरिटोनियल इंजेक्शन आसानी से किया जा सकता है और इंजेक्शन की वजह से आंतरिक अंगों को चोटों के जोखिम को कम कर देता है । - 3 दिनों के लिए पानी और खाद्य विज्ञापन libitum के साथ माउस को बनाए रखने । प्रतिदिन पशुओं के शरीर के वजन व भोजन के सेवन पर नजर रखें । शरीर के वजन घटाने 3 दिनों के भीतर 10% से अधिक है, तो प्रयोग से पशु को छोड़ दें ।
- 3 दिनों के बाद, एक बंद बॉक्स में sevoflurane द्वारा तेजी से संज्ञाहरण उत्प्रेरण के बाद गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन के द्वारा माउस euthanize । वैकल्पिक रूप से, माउस को euthanize करने के लिए स्थानीय पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित एक विधि का उपयोग करें ।
- एक डिश में माउस रखो (एक 10 सेमी व्यास के साथ) ७५% इथेनॉल के साथ निष्फल करने के लिए, और यह जल्दी से डाकू को हस्तांतरण । माउस को एक प्लेट पर रखें और माउस की स्थिति ठीक करने के लिए बोर्ड पर सामने पंजा पिन करें ।
- एक 5 मिलीलीटर एक 20 ग्राम सुई से जुड़ी सिरिंज का उपयोग करना, सुई बेवल एक 30 °-४० ° कोण पर रखकर, ठंड के 5 मिलीलीटर सुई (4-10 ° c) है चूहे पेरिटोनियल गुहा में पेट के निचले स्तर पर खारा (पंजाब), आंत्र puncturing से परहेज । यदि आंत्र (या किसी अंय अंग) पंचर है, माउस और उसकी कोशिकाओं अब प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में यह कोशिकाओं है कि प्राथमिक सेल संस्कृति के लिए उपयुक्त नहीं है सक्रिय कर सकते हैं ।
- माउस के पेट के दोनों किनारों पर एक कोमल मालिश करते हैं । फिर, द्रव को धीरे से महाप्राण । एक ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में पेरिटोनियल द्रव वितरण । दोहराएं इन चरणों 2x या 3x ।
- एक प्रशीतित केंद्रापसारक में ४०० x g पर 10 मिनट के लिए निलंबित कोशिकाओं केंद्रापसारक (4-8 डिग्री सेल्सियस) । supernatant त्यागें और RPMI १६४० मध्यम में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ सेल गोली resuspend । कोशिकाओं गिनती । Empirically, सेल घनत्व के लगभग बराबर है 5 x 106 कोशिकाओं/एमएल जब कोशिकाओं के माध्यम से 10 मिलीलीटर में resuspend कर रहे हैं ।
- 5 एक्स 106 कोशिकाओं के प्रवाह cytometry परख और 5 x 105 के लिए एक अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुआं में एक 24-अच्छी तरह से एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के लिए थाली में जोड़ें । संस्कृति ३७ ° c में एक 5% CO2 मशीन रातोंरात में कोशिकाओं । nonadherent कोशिकाओं को निकालने के लिए 3 ज के बाद कल्चर मीडियम को रिफ्रेश किया जा सकता है क्योंकि इनमें से ज्यादातर लिम्फोसाइटों होते हैं । अनुयाई कोशिकाओं को मुख्य रूप से मैक्रोफेज हैं, और वे ऊतक-संस्कृति का इलाज प्लास्टिक के लिए अच्छी तरह से पालन कर सकते हैं ।
3. मैक्रोफेज phagocytosis परख प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग
- कोशिका व्यवहार्यता और कोशिका घनत्व का मूल्यांकन करने के लिए एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें ।
- कल्चरल मीडियम को 24 वेल प्लेट से हटा लें । ताजा संस्कृति मध्यम और बैक्टीरियल निलंबन के 10 µ एल के १०० µ एल जोड़ें (लगभग 2 एक्स 107 कोशिकाओं) में प्रत्येक अच्छी तरह के रूप में 1 तालिकामें वर्णित है । एक ३७ ° c, 5% CO2 मशीन में 1 एच के लिए मशीन ।
- धीरे से धो 3x-ठंडे पंजाबियों के ५०० µ एल के साथ 5x अच्छी तरह से प्रति गैर आंतरिक बैक्टीरिया धोने के लिए ।
- 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर पंजाब में 4% formaldehyde के साथ कोशिकाओं की मशीन ।
- पंजाब के साथ 3x निश्चित कोशिकाओं को धो लें (५०० µ l/
- जोड़ें २०० µ एल के phalloidin ६३३ प्रतिदीप्ति डाई संयुग्मित काम समाधान ( सामग्री की तालिकादेखें) के लिए एफ actin दाग । एक अंधेरे में स्टोर, आर्द्र जगह (60%-८०%) ६० मिनट के लिए कमरे के तापमान पर । पंजाबियों के साथ 3x कुल्ला (५०० µ l/किसी भी अतिरिक्त phalloidin को दूर करने के लिए । F-actin दाग द्वारा, कोशिका द्रव्य और रेखांकित किया जा सकता है आंतरिक बैक्टीरिया भेद करने में मदद ।
- जोड़ें २०० µ एल के DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) काम समाधान (1 µ g/एमएल) के लिए सेल नाभिक दाग और कमरे के तापमान पर एक काले, आर्द्र जगह में 5 मिनट के लिए मशीन । पंजाबियों के साथ कुल्ला 1x (५०० µ एल/अच्छी तरह से) और आसुत जल की एक ही मात्रा के साथ 1x । फिर, कोशिकाओं एक औंधा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत अवलोकन के लिए तैयार हो जाएगा ।
4. मैक्रोफेज phagocytosis परख का उपयोग प्रवाह cytometry
- प्रयोगात्मक त्रुटियों को कम करने और परिणामों की एक उचित व्याख्या करने के लिए, समूह और 2 तालिकामें सूचीबद्ध के रूप में प्रयोग के लिए नियंत्रण ट्यूबों सेट ।
- नियंत्रण समूह के लिए, जो बर्फ पर रखा जाएगा ( 2 तालिकामें समूह 4), 6-खैर प्लेट से मध्यम निकालें और इसे पंजाबियों के साथ 1x धो लें । फिर, कोशिकाओं को अलग करने और उन्हें प्रवाह cytometry ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण करने के लिए अच्छी तरह से में ७० mM कोल्ड EDTA की 1 मिलीलीटर जोड़ें । ट्यूब में बैक्टीरियल सस्पेंशन के ५० µ एल जोड़ें और इसे बर्फ पर 1 एच के लिए जगह है ।
- अंय समूहों के लिए, संस्कृति माध्यम को हटा दें । एक अच्छी तरह से में ताजा माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें । समूह सेटिंग के अनुसार कुओं में बैक्टीरियल सस्पेंशन के ५० µ एल जोड़ें, के रूप में तालिका 2में वर्णित है । फिर, ३७ ° c, 5% सह2 मशीन में 1 एच के लिए 6 अच्छी तरह से थाली प्लेस ।
- के लिए आंतरिक रूप से ई. कोलाईके प्रतिदीप्ति बुझाने के लिए, ०.८% क्रिस्टल वायलेट (CV) अच्छी तरह से और बोलबाला में पानी के समाधान के २०० µ एल जोड़ने के शीघ्र ही, इस प्रकार EGFP द्वारा एक झूठी सकारात्मक परिणाम से बचने- ई. कोलाई की सतह को बाध्यकारी व्यक्त मैक्रोफेज लेकिन आंतरिक नहीं । किसी भी अवशिष्ट CV हटाने के लिए पंजाब के साथ 3x कोशिकाओं धो लो ।
- फिर, कोशिकाओं को अलग करने और उन्हें प्रवाह cytometry ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण करने के लिए अच्छी तरह से में ७० mM कोल्ड EDTA की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
- 5 मिनट के लिए ४०० x g पर ट्यूबों केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
- कक्षों को पुनर्निलंबित करने के लिए पंजाब के १०० µ एल जोड़ें । F4/80-pe-संयुग्मित एंटीबॉडी (एक सतह प्रतिजन माउस मैक्रोफेज पर व्यक्त) ट्यूबों में, या उपयोग IgG2a-पीई isotype, समूह की स्थापना के अनुसार की 5 µ l जोड़ें । भंवर संक्षेप में और अंधेरे में 5-10 मिनट के लिए बर्फ पर नमूनों की मशीन ।
- प्रत्येक ट्यूब में पंजाबियों की 1 मिलीलीटर जोड़ें और 5 मिनट के लिए ४०० x g पर केंद्रापसारक । supernatant को छोड़ें । 200-300 प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए पंजाब के µ एल के साथ सेल छर्रों resuspend । प्रत्येक ट्यूब चलाने के लिए और F4/80+ कोशिकाओं के कम से १०,००० घटनाओं के लिए डेटा प्राप्त ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
पीईटी-सूमो वेक्टर ई. कोलाईमें देशी प्रोटीन की अभिव्यक्ति की अनुमति देने के लिए एक छोटे ubiquitin की तरह संशोधक का इस्तेमाल करता है । सूमो फ्यूजन काफी EGFP घुलनशीलता में वृद्धि कर सकते हैं, यह आसानी से पता लगाया जा करने की अनुमति । यदि EGFP अभिव्यक्ति को सफलतापूर्वक लैक्टोज द्वारा प्रेरित किया जाता है, तो हरी कालोनियों को अंधेरे में देखा जा सकता है (आंकड़ा 1a) । ग्रीन डॉट्स, जो EGFP व्यक्त ई. कोलाईप्रतिनिधित्व करते हैं, एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत एक 40x उद्देश्य लेंस का उपयोग कर देखा जा सकता है (आंकड़ा 1b) ।
सूक्ष्म विश्लेषण युवा और वृद्ध समूहों से पेरिटोनियल मैक्रोफेज की प्रतिदीप्ति छवियों (चित्रा 1C) से पता चलता है । चित्रा 1C के लाल प्रतिदीप्ति से पता चलता है F-actin, EGFP के ग्रीन प्रतिदीप्ति-व्यक्त ई. कोलाई, प्रतिदीप्ति परमाणु धुंधला के नीले DAPI, और सभी तीन प्रतिदीप्ति चैनलों की विलय छवि । 16 महीने पुराने चूहों, जो वृद्ध चूहों के रूप में माना जाता था, ६० के बराबर थे-करने के लिए ६५ वर्षीय मानव. इन छवियों का सुझाव है कि युवा चूहों से मैक्रोफेज वृद्ध चूहों से उन लोगों की तुलना में एक मजबूत phagocytosis क्षमता प्रस्तुत की.
फ्लो cytometry (चित्रा 2) मात्रा और युवा और वृद्ध समूह से मैक्रोफेज phagocytosis तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । चित्रा 2a युवा, वृद्ध, और नियंत्रण समूहों के एक प्रतिनिधि प्रवाह cytometry विश्लेषण से पता चलता है । F4/80-PE एंटीबॉडी की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था और मैक्रोफेज गेट, और EGFP-सकारात्मक संकेत मैक्रोफेज कि phagocytosed ई. कोलाईइंगित करते हैं । F4/80+ और EGFP+ कोशिकाओं का अनुपात मैक्रोफेज की phagocytic क्षमता को इंगित करता है । युवा समूह के परिणाम (चित्रा बी) ६२.७% ± ५.१% (± sem मतलब) है, जो काफी था ३५.२% ± २.९% से अधिक था (± sem) वृद्ध समूह की । ये परिणाम प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपिक परिणामों की प्रवृत्ति के अनुरूप हैं.
चित्रा 1 : EGFP-व्यक्ती ई. कोलाई और मैक्रोफेज द्वारा अपने phagocytosis । (क) EGFP-व्यक्त ई. कोलाई कालोनियाँ. पीईटी-सुमो-EGFP प्लाज्मिड BL21 (DE) कोशिकाओं में तब्दील हो गया था; यह जीवाणु एक LB-कनमीसिन (१०० µ g/mL) प्लेट पर inoculated थे । पौंड प्लेट सतह पर ०.५ mmol/L लैक्टोज की एक कोटिंग उत्प्रेरण के रूप में इस्तेमाल किया गया था, EGFP अभिव्यक्ति उपज । यदि EGFP सफलतापूर्वक व्यक्त किया जाता है, पीले हरे रंग की कालोनियों अंधेरे में यूवी प्रकाश का उपयोग कर मनाया जाता है । (ख) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी ऑफ EGFP-व्यक्ती ई. कोलाई. ग्रीन सिग्नल EGFP व्यक्त ई. कोलाईका प्रतिनिधित्व करता है । स्केल बार = ५० µm. (C) मल्टीचैनल प्रतिदीप्ति मैक्रोफेज की छवियां कि phagocytosing ई. कोलाईथे । कोशिकाओं के साथ EGFP-व्यक्त ई. कोलाई (हरा) के लिए 1 ज, पंजाबियों के साथ एक धोने के बाद, 4% paraformaldehyde के साथ निर्धारण, और एफ के लिए धुंधला-actin का उपयोग phalloidin ६३३ संयुग्मी काम समाधान (लाल) और DAPI (नीला) । स्केल बार = १०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2 : प्रवाह cytometry परिणाम । (क) युवा, वृद्ध और नियंत्रण समूहों का प्रतिनिधि प्रवाह cytometry विश्लेषण. पेरिटोनियल मैक्रोफेज EGFP-व्यक्त ई. कोलाईके साथ coincubation के बाद F4/80-पीई के साथ दाग थे । F4/80+ और EGFP+ कोशिकाओं नकारात्मक नियंत्रण और नियंत्रण में दुर्लभ थे (समूह 4: बर्फ पर युवा समूह) समूह । युवा और वृद्ध प्रवाह cytometric भूखंड क्रमश: 5 और 6 समूहों का प्रतिनिधित्व करते हैं । (ख) युवा और वृद्ध समूहों के प्रवाह cytometry विश्लेषण से परिणाम. इन दोनों समूहों के बीच अंतर की जांच के लिए एक मान-Whitney टेस्ट का इस्तेमाल किया गया । F4/80+ और युवा समूह में EGFP+ कोशिकाओं के अनुपात से काफी अधिक था कि वृद्ध समूह में (*P < ०.०५) । त्रुटि पट्टियों (SEM) माध्य के मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| समूह | नाम | कक्षों | EGFP ई. कोलाई | सह मशीन समय |
| 1 | युवा | 2 x 105 | 2 x 107 | 1 ज |
| 2 | आयु वर्ग | 2 x 105 | 2 x 107 | 1 ज |
तालिका 1: प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए समूह सेटिंग. दो समूहों, वृद्ध समूह (१६ माहीय C57BL/6, n = 3) और युवा समूह (8 सप्ताहीय C57BL/6, n = 3), पेरिटोनियल मैक्रोफेज तैयार करने के लिए उपयोग किया गया । प्रत्येक चूहे के पेरिटोनियल मैक्रोफेज को पृथक कुओं से जोड़ा गया. लगभग 2 x 105 १०० µ एल की एक मात्रा में कोशिकाओं को एक अच्छी तरह से जोड़ा गया; फिर, लगभग 2 x 107 EGFP-व्यक्त ई. कोलाई कोशिकाओं के एक खंड में 10 µ l के लिए जोड़ा गया था एक अच्छी तरह से और coincubated के लिए 1 ज पर ३७ ° c.
| समूह | नाम और शर्त | कक्षों | EGFP | F4/80-PE | पे ISOTYPE |
| ई. कोलाई | |||||
| 1 | 37 डिग्री सेल्सियस पर Isotype नियंत्रण | 2 x 106 | — | — | 5 μL जोड़ें |
| 2 | 37 डिग्री सेल्सियस पर सकारात्मक नियंत्रण पीई | 2 x 106 | — | 5 μL जोड़ें | — |
| 3 | EGFP 37 डिग्री सेल्सियस पर सकारात्मक नियंत्रण | 2 x 106 | 1 x 108 | — | — |
| 4 | युवा समूह पर बर्फ | 2 x 106 | 1 x 108 | 5 μL जोड़ें | — |
| 5 | युवा समूह में 37 ° c | 2 x 106 | 1 x 108 | 5 μL जोड़ें | — |
| 6 | 37 डिग्री सेल्सियस पर आयु समूह | 2 x 106 | 1 x 108 | 5 μL जोड़ें | — |
तालिका 2: प्रवाह cytometry के लिए समूह सेटिंग । युवा और वृद्ध चूहों से प्राथमिक पेरिटोनियल मैक्रोफेज को छह समूह के रूप में निर्धारित किया गया । समूह 1 isotype नियंत्रण के रूप में सेट किया गया था; 2 और 3 समूहों क्रमशः पीई या EGFP चैनल के लिए एकल सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेट किया गया । यह सुनिश्चित करने के लिए कि आंतरिक प्रतिदीप्ति phagocytosis के लिए विशिष्ट है, 4 समूह बर्फ पर मशीन था । phagocytosis कम तापमान की वजह से बर्फ पर रोक लगी है । मशीन समय सभी समूहों के लिए 1 ज था ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
इस प्रोटोकॉल में कदम काफी सरल और सीधा कर रहे हैं । एक महत्वपूर्ण कदम के लिए ई. कोलाईपर EGFP अभिव्यक्ति प्रेरित है । आमतौर पर, जब eukaryotes से एक जीन, EGFP की तरह, ई. कोलाईकी तरह prokaryotes में व्यक्त करने की योजना बनाई है, वहां एक जोखिम है कि प्रोटीन निष्क्रिय समुच्चय (शामिल निकायों), जो प्रोटीन की मूल संरचना और गतिविधि परिवर्तन फार्म का होगा । पीईटी-सूमो वेक्टर का उपयोग करके और पीईटी-सूमो-EGFP प्लाज्मिड का निर्माण करके, EGFP-सूमो फ्यूजन प्रोटीन सफलतापूर्वक व्यक्त किया, और प्रकाश संकेत दोनों एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप और एक प्रवाह cytometer द्वारा पता लगाया जा करने के लिए काफी मजबूत था ।
अंय महत्वपूर्ण कदम के लिए बैक्टीरिया जो मैक्रोफेज द्वारा आंतरिक नहीं थे की प्रतिदीप्ति बुझाने के लिए है । हालांकि Trypan ब्लू को fluorescein isothiocyanate (FITC) के प्रतिदीप्ति बुझाने के लिए दिखाया गया है-लेबल, गर्मी में मारे गए बैक्टीरिया, यह जीना ई. कोलाईके लिए काम नहीं किया । एक ०.८% क्रिस्टल वायलेट पानी समाधान का उपयोग कर ई. कोलाई जो सेल सतह पर बांध के प्रतिदीप्ति के सबसे बुझा सकते हैं । कुछ साहित्य से पता चलता है कि एंटीबायोटिक दवाओं के साथ धोने के बजाय Trypan नीले प्रतिदीप्ति बुझाने में मदद कर सकते हैं, लेकिन है कि इस प्रयोग10में प्रभावी नहीं था ।
सेल घनत्व इस तकनीक को सीमित कर सकते हैं । क्योंकि कोशिकाओं लिम्फोसाइटों और मैक्रोफेज का एक मिश्रण से मिलकर बनता है, मैक्रोफेज आमतौर पर hemocytometer से गणना जब माउस पेरिटोनियल गुहा, जो एक अपर्याप्त संख्या में परिणाम हो सकता है से कोशिकाओं कटाई जब कोशिका घनत्व से कम कर रहे है प्रवाह cytometry और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए कोशिकाओं की । मैक्रोफेज की अपर्याप्त संख्या के मामले में, एक ही समूह के भीतर दो से तीन चूहों से कोशिकाओं phagocytosis परख के लिए मिश्रण हो सकता है । जब इस तकनीक को मैक्रोफेज सेल लाइनों पर लागू किया जाता है, जैसे रॉ 264.7, कोशिका हानि चिंता का विषय हो सकती है, क्योंकि ये कोशिकाएँ अपेक्षाकृत nonadherent हैं; इस प्रकार, कोशिकाओं को धोने की प्रक्रिया के दौरान खो सकता है । धीरे से धोएं या सेल-इलाज सतहों के साथ कल्चर प्लेट्स का उपयोग करें, जो सेल आसंजन को बढ़ा सकते हैं ।
phagocytosis क्षमता का आकलन करने के लिए कई अन्य विधियाँ हैं. क्लासिक तरीकों में से एक के रूप में, चिकन एरिथ्रोसाइट्स या दाग मृत कोशिकाओं phagocytosis के मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया । इन पद्धतियों की संवेदनशीलता परिणामों की काफी भिन्नता तक सीमित थी. phagocytosis की जांच के लिए एक अंय वैकल्पिक विधि के लिए कई घंटे के लिए बैक्टीरिया से संक्रमित कोशिकाओं का उपयोग है, तो लाइसे ट्राइटन X-१०० और प्लेट के साथ एक पौंड आगर पेट्री डिश पर रातोंरात ३७ डिग्री सेल्सियस पर । phagocytic क्षमता कॉलोनी बनाने वाली यूनिटों की संख्या (CFUs)6की गिनती करके निर्धारित की जाती है । CFU डेटा प्राप्त करने के लिए 2 दिनों के रूप में लंबे समय के रूप में आवश्यक यह विधि, और गिने संख्या के प्रसरण बड़ी थी क्योंकि कक्ष lysates कई बार पतला कर रहे हैं । फिर, FITC-बला मोतियों7 या ई. कोलाई 8phagocytosis परख के लिए शुरू किए गए थे । क्योंकि इन मोतियों की कमी विशिष्ट सतह एंटीजन, अतिरिक्त preopsonization इष्टतम के लिए आवश्यक था । इसके अलावा, FITC-लेबल बैक्टीरिया का उपयोग करने की विधि phagocytosis बाधा हो सकती है क्योंकि FITC बैक्टीरिया डाह9समझौता ।
एक और नव शुरू विधि व्यावसायिक रंगों का उपयोग करने के लिए है, जो पीएच संवेदनशील और केवल fluoresce एक बार वे अंलीय lysosome के अंदर हैं, इस प्रकार शमन कदम10को नष्ट करने । हालांकि, व्यावसायिक किट लागत निषेध हो सकता है । एक बार EGFP-व्यक्त ई. कोलाई तनाव का निर्माण किया है, बैक्टीरिया आसानी से reproduced हैं, और प्रतिदीप्ति कई हफ्तों के लिए स्थिर है, जो इस विधि सरल और किफायती बनाता है । क्योंकि EGFP एक मजबूत प्रतिदीप्ति है, इस विधि भी एक उच्च प्रवाह fluorometric तकनीक के लिए परिवर्तनीय हो सकता है मैक्रोफेज phagocytosis, जो एक अपारदर्शी ९६-अच्छी तरह से11प्लेट में किया जा सकता है का आकलन करने के लिए ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
चीन की राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (सं. ३१८०००४६) और लियाओनिंग प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (सं. २०१७०५४०२६२) ने इस काम का समर्थन किया । यह काम डालियां मेडिकल यूनिवर्सिटी के दूसरे अस्पताल में वैज्ञानिक अनुसंधान केंद्र की प्रयोगशालाओं में निपुण था. लेखक जिओ-लिन धंयवाद करना चाहते है प्रवाह cytometry के साथ उसकी सहायता के लिए गाया था, और बो Qu और दांग-छुअन यांग वीडियो उत्पादन में उनकी सहायता के लिए ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | - | |
| Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody | Biolegend | Cat101303 | |
| Champion pET SUMO Protein Expression system | Invitrogen | K300-01 | |
| Custom Gene Synthesis Service | Takara Biotech. | - | |
| DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher | D1306 | |
| F4/80-PE anti-mouse antibody for FACS | Biolegend | Cat123110 | |
| Leica DMI3000 B Inverted Microscope | Leica Microsystems | - | |
| PE Rat IgG2a, κ-isotype control | Biolegend | Cat400507 | |
| Phalloidin 633 fluorescence dye conjugated working solution | AAT Bioquest | Cat23125 | |
| Thioglycollate medium | Sigma-Aldrich | T9032 |
References
- Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. Journal of Visualized Experiments. 98, e52749 (2015).
- Iskander, K. N., et al. Sepsis: multiple abnormalities, heterogeneous responses, and evolving understanding. Physiological Reviews. 93 (3), 1247-1288 (2013).
- Girard, T. D., Opal, S. M., Ely, E. W. Insights into severe sepsis in older patients: from epidemiology to evidence-based management. Clinical Infectious Diseases. 40 (5), 719-727 (2005).
- Bicker, H., et al. A simple assay to measure phagocytosis of live bacteria. Clinical Chemistry. 54 (5), 911-915 (2008).
- Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E.
- Chen, Q., et al. Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (2), 201-212 (2013).
- Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of Macrophage Early and Late Endosomes by Latex Bead Internalization and Density Gradient Centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2015).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
- Weingart, C. L., et al. Fluorescent labels influence phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils. Infection and Immunity. 67 (8), 4264-4267 (1999).
- Neaga, A., Lefor, J., Lich, K. E., Liparoto, S. F., Xiao, Y. Q. Development and validation of a flow cytometric method to evaluate phagocytosis of pHrodo BioParticles(R) by granulocytes in multiple species. Journal of Immunological Methods. 390 (1-2), 9-17 (2013).
- Ninkovic, J., Roy, S. High throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization. Journal of Visualized Experiments. (93), e52195 (2014).
