Candida albicans के कुशल जीनोम इंजीनियरिंग रोगजनन और चिकित्सकीय के विकास को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । यहां, हम जल्दी और सही CRISPR का उपयोग कर सी albicans जीनोम को संपादित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया । प्रोटोकॉल जांचकर्ताओं बिंदु उत्परिवर्तनों, निवेशन, और विलोपन सहित आनुवंशिक संशोधनों की एक विस्तृत विविधता लागू करने की अनुमति देता है ।
इस विधि का वर्णन द्विगुणित मानव कवक रोगज़नक़ Candida albicans के कुशल CRISPR मध्यस्थता जीनोम संपादन । CRISPR- सी albicans में मध्यस्थता जीनोम संपादन Cas9, गाइड आरएनए, और मरंमत टेम्पलेट की आवश्यकता है । एक प्लाज्मिड एक खमीर codon अनुकूलित Cas9 (CaCas9) व्यक्त उत्पंन किया गया है । गाइड एक पाम साइट से सीधे ऊपर अनुक्रम (NGG) Cas9 अभिव्यक्ति वेक्टर में क्लोन कर रहे हैं । एक मरंमत टेम्पलेट तो इन विट्रो मेंप्राइमरी एक्सटेंशन द्वारा किया जाता है । मरंमत के Cotransformation टेंपलेट और सदिश सी. albicans में जीनोम संपादन की ओर जाता है । उपयोग किए गए सुधार टेम्पलेट के आधार पर, जांचकर्ता न्यूक्लियोटाइड परिवर्तन, सम्मिलन या हटाए जाने का परिचय दे सकता है. के रूप में C. albicans एक द्विगुणित है, उत्परिवर्तनों एक जीन के दोनों alleles में किए गए हैं, बशर्ते कि ए और बी alleles बंदरगाह SNPs कि गाइड लक्ष्यीकरण या मरंमत टेंपलेट शामिल करने के साथ हस्तक्षेप नहीं है । Multimember जीन परिवारों समानांतर में संपादित किया जा सकता है अगर उपयुक्त संरक्षित अनुक्रम परिवार के सभी सदस्यों में मौजूद हैं । C. albicans CRISPR प्रणाली FRT साइटों और encodes flippase द्वारा पार्श्व है । flippase की प्रेरण पर, एंटीबायोटिक मार्कर (CaCas9) और गाइड आरएनए जीनोम से हटा रहे हैं । यह जांचकर्ता जीनोम करने के लिए अनुवर्ती संपादन करने के लिए अनुमति देता है । c. albicans CRISPR एक शक्तिशाली कवक आनुवंशिक इंजीनियरिंग उपकरण है, और वर्णित प्रोटोकॉल के लिए मामूली परिवर्तन सी. glabrata, एन castellii, और एस cerevisiaeसहित अंय कवक प्रजातियों के संशोधन की अनुमति है ।
Candida albicans सबसे प्रचलित मानव कवक रोगज़नक़1,2,3है । सी albicans और स्तनधारी आणविक जीव विज्ञान के बीच मतभेदों को समझना रोधी चिकित्सकीय की अगली पीढ़ी के विकास के लिए महत्वपूर्ण है । यह जांचकर्ताओं की आवश्यकता को जल्दी और सही आनुवंशिक रूप से C. albicansहेरफेर करने में सक्षम हो ।
सी albicans के आनुवंशिक हेरफेर ऐतिहासिक चुनौती दी गई है । C. albicans plasmids बनाए रखने नहीं करता है, इस प्रकार सभी निर्माणों जीनोम में शामिल किया जाना चाहिए । इसके अलावा, सी albicans द्विगुणित है; इसलिए, जब एक जीन दस्तक या एक उत्परिवर्तन शुरू, यह सुनिश्चित करना है कि दोनों प्रतियां4बदल दिया गया है महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, कुछ सी. albicans loci heterozygous हैं, आगे आनुवंशिक पूछताछ5उलझी हुई है । आनुवंशिक रूप से C. albicansमें हेरफेर करने के लिए, यह मुताबिक़ पुनर्संयोजन6के कई दौर प्रदर्शन करने के लिए विशिष्ट है । हालांकि, जीनोम और श्रमसाध्य के निर्माण के विकास के द्विगुणित प्रकृति यह एक संभावित थकाऊ प्रक्रिया बना दिया है, खासकर अगर एक से अधिक परिवर्तन की आवश्यकता है । इन सीमाओं और albicans के चिकित्सा महत्व नई प्रौद्योगिकियों के विकास की मांग है कि जांचकर्ताओं को सक्षम करने के लिए और अधिक आसानी से सी. albicans जीनोम हेरफेर ।
संकुल नियमित रूप से अंतराल लघु palindromic दोहराता है (CRISPR)-मध्यस्थता जीनोम संपादन एक शक्तिशाली उपकरण है कि शोधकर्ताओं ने एक जीनोम के अनुक्रम बदलने के लिए अनुमति देता है । CRISPR तीन घटकों की आवश्यकता है: 1) Cas9 nuclease कि लक्ष्य डीएनए, 2) एक 20 आधार गाइड आरएनए कि लक्ष्य Cas9 ब्याज के अनुक्रम के लिए, और 3) मरंमत टेंपलेट डीएनए कि मरंमत दरार साइट और इरादा परिवर्तन7शामिल हैं, 8. एक बार गाइड लक्ष्य जीनोम अनुक्रम को Cas9 लाता है, Cas9 एक protospacer आसंन आकृति (पाम) अनुक्रम (NGG) सीधे गाइड अनुक्रम के ऊपर डीएनए9सट करने की आवश्यकता है । दोनों 20 आधार गाइड और पाम दृश्यों के लिए आवश्यकता लक्ष्यीकरण विशिष्टता और सीमा से लक्ष्य दरार की एक उच्च डिग्री प्रदान करता है ।
CRISPR प्रणालियों के लिए जीवों की एक विविध सेट के जीनोम संपादित करें और10समस्याओं की एक विस्तृत विविधता से निपटने के लिए डिजाइन किया गया है । यहां वर्णित है एक लचीला, संपादन के लिए कुशल CRISPR प्रोटोकॉल एक सी. albicans ब्याज की जीन । प्रयोग एक जीन के लिए एक बंद codon परिचय, अनुवाद समाप्ति के कारण । सुधार टेम्पलेट प्रस्तुत किया गया है के आधार पर अन्य संपादन किए जा सकते हैं । nourseothricin (Natr) युक्त खमीर codon-अनुकूलित Cas9 (CaCas9) और एक गाइड आरएनए के साथ चिह्नित एक टुकड़ा एक तटस्थ स्थल पर सी. albicans जीनोम में शामिल किया गया है । मरंमत टेंपलेट के साथ Cotransformation वांछित उत्परिवर्तन कूटबंधन मुताबिक़ पुनर्संयोजन और कुशल जीनोम संपादन द्वारा दरार की मरंमत की ओर जाता है । नीचे वर्णित TPK2का संपादन है, लेकिन सभी C. albicans ओपन रीडिंग फ्रेम CRISPR द्वारा कई बार लक्षित किया जा सकता है । CRISPR प्रणाली FRT साइटों द्वारा पार्श्व है और CaCas9 अभिव्यक्ति प्लाज्मिड पर इनकोडिंग flippase की प्रेरण द्वारा सी. albicans जीनोम से हटाया जा सकता है । c. albicans CRISPR सिस्टम जांचकर्ताओं को सटीकता से सक्षम बनाता है और c. albicans जीनोम11,12को तुरंत संपादित करता है ।
c. albicans CRISPR कुशलता से c. albicans जीनोम को संपादित करता है । pV1524 encodes एक खमीर codon-अनुकूलित Cas9 और इस तरह बनाया गया है कि जांचकर्ताओं आसानी से क्लोन गाइड आरएनए CaSNR52 प्रमोटर (चित्रा 1)11के अनुप्रवाह अनुक्रम कर सकते हैं । यह सुनिश्चित किया जाना चाहिए कि केवल गाइड अनुक्रम की एक प्रतिलिपि अनुक्रमण द्वारा CaCas9 अभिव्यक्ति वैक्टर में क्लोन किया गया है, के रूप में अतिरिक्त प्रतियां जीनोम संपादन में बाधा होगी । यदि गाइड की एकाधिक प्रतियां लगातार पेश कर रहे हैं, एक annealed बंधाव में इस्तेमाल किया गाइड की एकाग्रता कम करना चाहिए । वेक्टर और प्रोटोकॉल वर्णित किसी भी सी albicans जीन के लक्ष्यीकरण की अनुमति । यद्यपि C. albicans द्विगुणित है, केवल एक ही परिवर्तन एक जीन के दोनों alleles को लक्षित करने के लिए आवश्यक है । इसके अलावा, CRISPR-CaCas9 जीनोम संपादन के जुलूस प्रकृति शोधकर्ताओं जीन परिवारों के कई सदस्यों को लक्षित करने के लिए सक्षम बनाता है । सी. albicans डाह के लिए कई जीन परिवारों जैसे स्रावित aspartyl का टीज़र (SAPS) और agglutinin जैसे सीक्वेंस प्रोटीन (ALS) महत्वपूर्ण होते हैं. CRISPR जीनोम संपादन इन जीन परिवारों की जांच की सुविधा होगी ।
ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल एक खुली पठन फ़्रेम के लिए एक रोकें codon शुरू, जिसके परिणामस्वरूप phenotypic एक नल (चित्रा 2) के बराबर है । आनुवंशिक प्रत्यावर्तन की एक विस्तृत विविधता की मरंमत टेंपलेट अलग से बनाया जा सकता है । बकवास, बकवास, और मूक उत्परिवर्तनों एक उपयुक्त मरंमत टेम्पलेट के साथ पुनर्संयोजन के माध्यम से डाला जा सकता है । एक प्रतिबंध साइट के शामिल किए जाने के रूपांतरण जांच को कारगर बनाने, के बिना उन के रूप में12,13अनुक्रमण द्वारा जांच की जानी चाहिए । इसके अलावा, C. albicans CRISPR के शोधकर्ताओं के सम्मिलन और विलोपन उत्पन्न करने के लिए सक्षम बनाता है, यह एक आदर्श प्रणाली संबध टैग डालने के लिए बना रही है, मोटर स्वैप प्रदर्शन, और नॉकआउट उत्पन्न (चित्रा 3). इन उत्परिवर्तनों के लिए सही transformants के लिए स्क्रीनिंग अधिक श्रमसाध्य है, के रूप में यह संपादन अनुक्रम के लिए आवश्यक है मरंमत की सही शामिल करने की पुष्टि टेंपलेट्स । इसके अलावा, दक्षिणी दाग के लिए एक जीन की अतिरिक्त प्रतियां सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हो सकता है जीनोम में अतिरिक्त स्थानों पर नहीं डाला गया है । NGG पाम साइट की आवश्यकता जीनोम है कि लक्षित किया जा सकता है के क्षेत्रों पर मामूली सीमाओं स्थानों । वैकल्पिक CRISPR प्रणालियों का विकास जो वैकल्पिक nucleases जैसे Cpf1 या Cas9 सिस्टम पर रूपांतरों का उपयोग करता है/इनमें से कई सीमाएं14को कम कर देगी । इस समय जांचकर्ताओं के ज्ञान के लिए, ये सिस्टम अभी तक C. albicansकरने के लिए लागू नहीं किया गया है ।
CRISPR प्रणाली के ऊपर प्रोटोकॉल में वर्णित है कि यह Saccharomyces cerevisiae, Naumouozyma castellii, और मानव रोगज़नक़ Candida glabrata11 सहित प्रजातियों की एक विस्तृत विविधता में लागू किया जा सकता है विकसित किया गया है . परिवर्तन और इन खमीर के कुशल संपादन वर्णित प्रोटोकॉल में मामूली परिवर्तन की आवश्यकता है, लेकिन इन वैकल्पिक जीनोम के संपादन के लिए रूपरेखा उल्लेखनीय है कि सी albicans12के लिए वर्णित के समान है । इसके अलावा, खमीर जीनोम संपादन प्रक्रियाओं को विकसित करने के लिए एक उत्कृष्ट तंत्र प्रदान करते हैं । खमीर में, जब ADE2 , adenine के लिए एक अग्रदूत साबित होता है संश्लेषण मार्ग जमा, कोशिकाओं को लाल मोड़ । यह आसानी से देख phenotype जांचकर्ताओं संपादित कोशिकाओं की पहचान करने के लिए और जल्दी से जीनोम संपादन प्रोटोकॉल का समस्या निवारण की अनुमति देता है । व्यापक आण्विक जीवविज्ञान कवक के लिए उपलब्ध उपकरण बॉक्स के साथ संयुक्त, संपादन के लिए प्रोटोकॉल कई खमीर प्रजातियों15,16विकसित किया गया है । कवक में जीनोम संपादन प्रौद्योगिकी के इस तरह के एक व्यापक आवेदन काफी वैज्ञानिक विषयों की एक विस्तृत विविधता को प्रभावित करने की क्षमता है ।
CRISPR बहुत सी albicansमें जीनोम इंजीनियरिंग की दक्षता में सुधार हुआ है, लेकिन तारीख CRISPR सी. albicansमें जीनोम वाइड स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया है । वर्तमान प्रोटोकॉल एक मरंमत के लिए उत्परिवर्तनों परिचय टेंपलेट की आवश्यकता है, nonhomologous के रूप में सी albicans में मार्ग में शामिल होने के अंत12अक्षम है । हर जीन के लिए मरंमत खाका ओलिगोस्पर्मिया की पीढ़ी जीनोम चौड़ा स्क्रीन के निष्पादन के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा है । डीएनए संश्लेषण और CRISPR प्रौद्योगिकियों को अग्रिम की कमी लागत का संगम विलोपन पुस्तकालयों के विकास को और अधिक संभव बना देगा । उदाहरण के लिए, CaCas9 वेक्टर से एक मरंमत टेंपलेट की अभिव्यक्ति स्थाई प्लाज्मिड पुस्तकालयों के विकास के लिए रास्ता प्रशस्त है कि हर11जीन लक्ष्य । इसके अलावा, क्षणिक Candida CRISPR प्रोटोकॉल है कि CaCas9 अभिव्यक्ति वेक्टर सी. albicans जीनोम में शामिल की आवश्यकता नहीं है17विकसित किया गया है । इसके अलावा, बढ़ा गाइड अभिव्यक्ति वृद्धि जीनोम संपादन क्षमता18। ये, और अंय CRISPR प्रौद्योगिकियों के लिए अग्रिम, सी albicansमें जीनोम चौड़ा स्क्रीन के विकास के लिए महत्वपूर्ण है19,20,21,22।
C. albicans जीनोम द्विगुणित होता है, लेकिन A और B alleles हमेशा समरूप5नहीं होते हैं । ऐसी heterozygosity चुनौतियों और अवसरों दोनों प्रदान करता है । यदि एक लक्ष्य दोनों alleles, एक पाम साइट, गाइड अनुक्रम, और मरंमत टेंपलेट है कि जीन की दोनों प्रतियां पर कार्य करेगा इस्तेमाल किया जाना चाहिए । तथापि, एक जीन में मौजूद एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपताओं के आधार पर, C. albicans CRISPR प्रणाली जांचकर्ताओं को एक एकल एलील को लक्षित करने में सक्षम बनाती है । ऐसी परिशुद्धता के लिए जांचकर्ताओं alleles के बीच कार्यात्मक मतभेदों की जांच करने की अनुमति की क्षमता है । विशिष्ट alleles लक्ष्यीकरण सावधानी से किया जाना चाहिए, के रूप में एक एलील या एक पूरे गुणसूत्र में heterozygosity (LOH) के नुकसान मनाया गया है । जब संपादन एकल सी albicans alleles, एक आसंन डीएनए अनुक्रम की जांच करने के लिए निर्धारित अगर एक क्लोन एक द्विगुणित SNP प्रोफ़ाइल बनाए रखा है चाहिए । इसके अलावा, बंद लक्ष्य प्रभाव सी albicans CRISPR के लिए काफी कम हैं, लेकिन पूरे जीनोम अनुक्रमण कुंजी उपभेदों के लिए विचार किया जा सकता है ।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों ने पांडुलिपि पर पढ़ने और उपयोगी टिप्पणियों के लिए डॉ॰ Gennifer मागेर का धन्यवाद किया । यह काम गेंद राज्य विश्वविद्यालय प्रयोगशाला स्टार्टअप कोष और NIH-1R15AI130950-01 से D.A.B. को समर्थन किया गया
Chemicals | |||
Agar | BD Bacto | 214010 | |
agarose | amresco | 0710-500G | |
Ampicillan | Sigma-Aldrich | A9518 | |
Bacto Peptone | BD Bacto | 211677 | |
Bsmb1 | New England Biolabs | R0580L | |
Calf intestinal phosphatase (CIP) | New England Biolabs | M0290L | |
Cut Smart Buffer | New England Biolabs | B7204S | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
dNTPs | New England Biolabs | N0447L | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | |
Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 2810000ACS | |
Glucose | BDH VWR analytical | BDH9230 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | 49767 | |
Kpn1 | New England Biolabs | R3142L | |
LB-Medium | MP | 3002-032 | |
Lithium Acetate | Sigma-Aldrich | 517992 | |
L-Tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | |
Maltose | Sigma-Aldrich | M5885 | |
Molecular Biology Water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
NEB3.1 Buffer | New England Biolabs | B7203S | |
Nourseothricin | Werner Bioagents | 74667 | |
Poly(ethylene glycol) PEG 3350 | Sigma-Aldrich | P4338 | |
Sac1 | New England Biolabs | R3156L | |
Salmon Sperm DNA | Invitrogen | AM9680 | |
T4 Polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | |
Taq polymerase | New England Biolabs | M0267X | |
Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | |
Yeast Extract | BD Bacto | 212750 | |
Equipment | |||
Electrophoresis Appartus | |||
Incubator | |||
Microcentifuge | |||
PCR machine | |||
Replica Plating Apparatus | |||
Rollerdrum or shaker | |||
Spectrophotometer | |||
Waterbath |