本文介绍了一种利用天然阳离子多糖壳聚糖和合成线性聚乙烯胺 (lpei) 涂层保护镁-贫化和富含核酸酶介质中 dna 折纸纳米结构的方案。
脱氧核糖核酸折纸纳米结构具有巨大的潜力, 可用于生物和医疗应用。然而, 生理流体中的低盐条件和核酸酶会导致自组装 dna 纳米结构的变性和降解。在非病毒基因传递中, dna 的酶降解是通过在阳离子壳中封装带负电荷的 dna 来克服的。在基因传递进步的启发下, 提出了一种简单、一步到位、鲁棒性强的 dna 折纸纳米结构稳定方法, 并将其涂覆在壳聚糖和线性聚乙烯胺中。多离子涂层有效地保护了 mg 耗尽和富含核酸酶的介质中的 dna 折纸纳米结构。该方法还保留了 dna 纳米结构的酶和应用系功能化的全部可寻址性。
dna 是纳米结构1可编程自组装的多功能构建块。最流行的 dna 纳米结构的方法是 dna 折纸技术, 它是基于一个长的圆形, 单链 dna 支架的自组装与数百更短的形状确定合成细管线2的帮助。如今, 在几乎任何几何和形态中创建 dna 纳米结构都是很容易的。dna 纳米结构可在高精度 3、4 的情况下进行特定功能化, 并可编程进行异构构象变化 5,6。因此, 使用 dna 作为建筑材料提供了一个独特的机会, 可以创建可编程和响应式定制设计的纳米结构, 用于生物传感、诊断和药物输送等领域。然而, dna 纳米结构容易被exo和endo核酸酶消化, 而基于网状的 3d dna 折纸纳米结构通常需要高盐度缓冲液 (例如5-20 mmmg + 2) 来保持其完整性7,8。
血液中存在的核酸酶和细胞外基质快速降解 dna 是在体内有效地将遗传物质传递到细胞9的主要障碍。为了克服这一限制, 在非病毒基因传递中, dna 与阳离子聚合物混合在一起, 以确定的 nsp 电荷比 (多阳离子中的胺与 dna 中的磷酸盐之比)10。与阳离子聚合物 (称为聚普莱丝) 的 dna 复合体保护 dna 免受核酸酶介导的降解, 并增强其细胞吸收11。灵感来自基因传递的进展, 寡溶氨酸12, 寡极素-聚乙二醇 (peg) 共聚物13, 聚 (2-二甲基氨基-乙基甲基丙烯酸酯) (pdmaema) 基聚合物14, 和病毒衣壳蛋白 15已被用于稳定脱氧核糖核酸折纸纳米结构。
最近, 我们报告了一种方法, 以保护 dna 折纸纳米结构在镁贫化和富含核酸酶的介质使用天然阳离子多糖壳聚糖和合成线性聚乙烯胺 (lpei) 被报道 16.本文是对我们早期工作的改编, 介绍了制备多层的详细协议、其特性、测试低盐和富含核酸介质中的裸和受保护纳米结构的稳定性以及对酶和功能化 dna 折纸纳米结构在多离子涂层上的可寻址性。
在 dna 折纸的自组装中, 主食线通常以5-10 的多余比添加到支架上。这些多余的订书条也结合到多阳离子, 并在一元计范围内形成多层, 这是更难以从 dna 折纸多层分离。因此, 多普形成的一个关键步骤是去除多余的短纤维链, 并使用纯化良好的 dna 折纸纳米结构。
其他方法已经开发出稳定 dna 纳米结构, 如通过点击反应26的 dna 链的环化。由于形成互锁单链环需要碱基和氮化物修饰的短纤维链, 这种技术对于稳定 dna 卡烯内等小型纳米结构是有限的, 对于较大的 dna 折纸来说是不容易扩展的结构, 如本协议中使用的结构。最近, gerling等人报告了一种利用紫外线照射在 dna 纳米结构内的相邻胸组织之间建立共价环布腾吡啶二聚体 (cpd) 键的方法。虽然该方法具有位点选择性和可扩展性, 但其保护 dna 折纸的效率远远低于多离子涂层。例如, cpd 稳定 dna 折纸对象在1小时内只持续 0.4 u/ml dnase i, 而多层体体在存在 10 u/ml dnase i 的情况下至少持续一天。
总之, 基因治疗启发壳聚糖和 lpei 涂层是一种低成本、一步、高效的方法, 可以解决 mg 枯竭和富含核酸酶的培养基中 dna 折纸纳米结构的长期稳定性问题。多普莱克斯形成的可逆性促进了其在多步骤诊断测试中的应用, 在多步骤中, 保护 dna 折纸免受核溶解降解或盐耗尽至关重要, 但可能会在 dna 等其他步骤中造成问题放大。此外, 多离子涂层是提高细胞对用于药物输送应用的 dna 折纸纳米结构的吸收的一种潜在方法28。
The authors have nothing to disclose.
根据第668477号赠款协议, 该项目获得了欧盟 “地平线 2020” 研究和创新计划的资助。在维也纳生物中心核心设施有限公司的 em 设施以80千伏的速度操作的 morgagni 上记录了 tem 图像。我们要感谢塔迪贾·凯基奇在图形设计方面的协助, 并感谢 elisa de liano 设计的线框纳米结构。
10× DNase I reaction buffer | New England Biolab (NEB) | B0303 | |
ABTS (2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt) | Alfa Aesar | J65535 | |
Amicon ultracentrifugation columns | Merck Millipore | UCF500308, UCF510024 | |
Chitosan oligosaccharide lactate (Mn ~ 4000-6000, > 90% deacetylated, 60%. composition oligosaccharide | Sigma-Aldrich | 523682 | |
Design-specific staple strands | Integrate DNA Technologies (IDT) | ||
Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 4 kDa) | Sigma-Aldrich | 75027 | |
Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 40 kDa) | Sigma-Aldrich | 42867 | |
DNA gel loading dye (6×) | ThermoFischer sceintific | R0611 | |
DNase I (RNase free) | New England Biolab (NEB) | M0303 | |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) | Sigma-Aldrich | EDS | |
Freeze'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns | Biorad | 7326165 | |
Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Hydrogen peroixde slution (32 wt%) | Sigma-Aldrich | 216763 | |
LPEI-25 kDa | Polysciences, Inc | 23966-1 | |
NuPAGE Sample Reducing Agent (500 mM dithiothreitol (DTT)) | ThermoFischer sceintific | NP0004 | |
Polyethylene glycol (PEG, MW ~ 8000 Da) | Carl Roth | O263.1 | |
Polyethylenimine, linear, average Mn 10,000, PDI ≤1.2 | Sigma-Aldrich | 765090 | |
Polyethylenimine, linear, average Mn 5,000, PDI ≤1.3 | Sigma-Aldrich | 764582 | |
Proteinase K solution (20 mg/ml) | ThermoFischer sceintific | AM2548 | |
Streptavidin-conjugated HRP | ThermoFischer sceintific | N100 | |
SYBER safe DNA gel stain | ThermoFischer sceintific | S33102 |