자동차 T 세포에 의해 회전 타원 체 살인 분석 결과

요약

이 프로토콜에 대 한 3 차원 구조적된 암 세포 (spheroids)에서 실시간으로 immunotherapeutic 리디렉션된 T-셀 (자동차 T-세포) 세포 독성을 평가 하기 위해 설계 되었습니다.

초록

Immunotherapy는 다르게 untreatable 암와의 싸움에서 성장 관심 분야를 되었다. 모든 immunotherapeutic 방법 중 공상 항 원 수용 체 (자동차) T 세포 특히 소아 B 급성 림프 구성 백혈병 (B-모두)와 함께 가장 아름 다운 결과 얻은 리디렉션됩니다. 클래식 유효성 검사 메서드가 자동차 T 세포의 특이성의 사용 정지에서 및이 종이 식 모델에서 대상 셀에 대 한 자동차 T 세포의 기능 분석에 의존합니다. 불행 하 게도, 생체 외에서 관측은 종종 vivo에서 얻은 결과에서 분리 하 고 다른 단계를 추가 하 여 많은 노력 및 동물을 아끼지 수: 3D 문화를 사용 하 여. 그들은 동물 모델에 engrafted는 때 종양 세포의 3 차원 구조를 모방 하는 잠재적인 대상 셀에서 spheroids의 생산 이상적인 대안을 나타냅니다. 여기, 우리는 (여기 CD19 자동차 T 세포에 의해 exemplified) 입양 세포 치료에 대 한 유효성 검사 도구로 불리고 장 셀 라인에서 spheroids를 생산 하는 저렴 하 고 신뢰할 수 있는 쉬운 방법 보고. 이 메서드는 회전 타원 체 성장 따를 수 있는 고급 라이브 이미징 시스템으로 결합, 이펙터 세포 세포 독성 그리고 종양 세포 apoptosis.

서론

입양 세포 이동 (ACT)는 다음 세대 암 치료를 나타냅니다. 그것은 환자에 효과 기 세포 (T-또는 NK-세포)의 주입에 사용합니다. 이 세포는 유전자 그들 그들의 목표는 종양을 안내 하 고 그것을 파괴 하는 수용 체와 함께 수정할 수 있습니다. 최근이 방법은 공상 항 원 수용 체 (차) B-세포 마커 CD19에 대 한 감독을 죽 일 자신의 암¹환자 T 세포에 도입 되었다 때 가능한 것으로 표시 했다. 인공 수용 체 자동차의 경우 디자인 구성 특정 항 체 파편의 바인딩 도메인은 엔터티 지정 된 단일 체인 변수 조각 (scFv), 감소 하는 항 T-세포 신호 도메인에 연결. 여러 디자인을 확인 하 고는, 가장 일반적으로 사용 되는 버전 2 세대의 자동차 디자인으로 이루어져 TCR 신호에 대 한 CD3z 및 co-stimulatory 도메인 참조 (CD28, 4-1BB, OX40, 등.) ^{1 , 2}. immunotherapy 필드 CD19 자동차-T 세포 efficaciously B 세포 악성 종양^3,4수많은 환자를 치료 법의 새로운 형태에 그....

프로토콜

1. 대 장 암 세포 선에서 Spheroids의 생성

1. 씻어 HCT 116 (클러스터 차별화 19 (CD19) 및 녹색 형광 단백질 (GFP)를 표현 하는 불리고 안정적) 셀 monolayers 인산 염과 식 염 수 (PBS, 25 cm² 또는 75 c m² 플라스 크에 10 mL 5 mL) 버퍼링. 트립 신 (0.5 mL 25 c m² 에 대 한 또는 75 c m² 플라스 크 1 mL)을 추가 하 고 5 분 동안 37 ° C에 세포를 품 어.
2. 현미경으로 세포 분리를 확인 하 고 완전 한 로스웰 파크 기념 연구소 160 매체 (RPMI 1640)와 셀 분리 효소를 무력화 (RPMI 1640 + 10 %FCS + Gentamycin; 10 mL 25 c m² 에 대 한 또는 75 c m² 플라스 크에 대 한 20 mL).
3. 5 분에 대 한 500 x g 에서 원심 분리기 세포 현 탁 액 표면에 뜨는 한 피 펫을 사용 하 여 제거 하 고 여러 번 완전 한 RPM1 1640 매체의 5 mL와 함께 아래로 pipetting으로 resuspend.
4. Trypan 블루 제외 호환 셀 카운터에 사용 하 여 ....

결과

그림 1에서 볼 수 있듯이 그것은 cytometry에 의해 T 세포 (그림 1A)에 CD19 자동차의 표현과 HCT116 종양 세포 라인 (그림 1B)에 CD19의 레벨의 수준을 확인 중요 합니다. 그림 2 는 전형적인 회전 타원 체 실험 결과 예로 보여주. 자동화 된 이미징 장치는 4 개의 다른 채널에서 사진을 찍는: 밝은 분야, 위상, 녹색과 적색 형광. 단계 채널 spheroids (회전 타원 체 형성의 표시에는) 근처 높은 대조 경계를 표시 하 여 spheroids의 형성을 주장 하는 데 사용 됩니다. 밝은 필드는 spheroids의 크기를 감지 하 여 상기 경계에 녹색 신호 (종양)과 빨간색 신호 (apoptosis)를 제한 분석 과정에서 사용 됩니다.......

토론

미래의 암 치료의 유효성을 검사 하는 혁신적인 도구 spheroids 사용 하 여 지난 몇 년 동안에서 성장 관심 분야 되고있다. Spheroids 클래식 2D 생체 외 분석과 생체 조건 평가 사이의 중간 단계를 나타냅니다. 추가 방법은 종양 미세 환경 유전자 프로 파일링⁷뿐만 아니라 흉내 낸 측면에서 그들의 힘에 관한 약속을 많이 보유 하고있다. 이 책에서 제시 하는 프로토콜은 Saheen에서 적응 Incucyte s 3 외.¹¹ 장 셀 라인에서 3D 종양 spheroids를 생산 하는 저렴 하 고 쉬운 방법을 나타냅니다. 높은 처리량 이미징 장치에 회전 타원 체 세대 커플링 안정적이 고 빠른 안티 종양 에이전트가의 광범위의 검열을 허용 하 고 종양 구조를 불안정 하 게 하는 상기 에이전트의 능력 모니터링.

이 프로토콜에 관한 고려 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 첫째, 종.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
둘베코' s 인산염 완충 식염수	SIGMA-ALDRICH	D8537-500ML	로트 번호: RNBG7037
75 cm² 성장 영역 플라스크	VWR	430639	로트 번호: 2218002
75 cm² 성장 영역 플라스크	VWR	734-2705	로트 번호: 3718006
Trypsin-EDTA	SIGM-ALDRICH	T3924-100ml	로트 번호: SLBTO777
RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 mL	Life Technology (Gibco)	21875-091	로트 번호: 1926384
Fetal bovine Serum	Gibco	10500064	로트 번호: 08Q3066K
Gentamicin	Thermo Fischer	15750060	로트 번호: 1904924A
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fischer	15250061	로트 번호: 1886513
96 웰 플레이트, 둥근 바닥	VWR	734-1797	로트 번호: 33117036
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	Thermo Fischer	11132D-X-VIVO
15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L	BioNordika	BE02-060Q	로트 번호: 8MB036
CTS 면역 세포 혈청 교체	Thermo Fischer		A2596102로트 번호: 1939319
IL-2 Proleukin	Novartis		로트 번호: 505938M
IncuCyte Annexin V Red Reagent	Essen Bioscience	4641	로트 번호: 17A1025-122117
시약 저장소	VWR	89094-672<	strong>로트 번호: 89094-672
15 mL 튜브	VWR	734-1867	로트 번호: 19317044
anti-human CD19-PE	BD Biosciences	555413	로트 번호: 4016990 RRID: AB_395813
비오틴-SP (긴 스페이서) AffiniPure F (ab ') 2< / sub> 단편 염소 안티 마우스 IgG	잭슨 ImmunoResearch	115-066-072	로트 번호 : < / strong> 129474 : RRID : < / strong> AB_2338583
Streptavidin-PE	BD Biosciences	554061	로트 번호 : 5191579 : RRID : AB_10053328
HCT 116 결장직장암 라인	ATCC	CCL-247-Incucyte
S3	Essen Bioscience