희생 빈 섬유 막 세포 배양을 통해 기질 섬유의 생산

Summary

이 프로토콜의 목표는 재생 비 계 임 플 란 트의 일환으로 전 임상 평가 위한 적당 한 상처 복구에 대 한 대상 전체 기질 섬유의 생산입니다. 이러한 섬유는 빈 섬유 막에 섬유 아 세포의 문화에 의해 생성 하 고 세포 막의 해체에 의해 추출.

Abstract

세포 외 기질 (ECM)에서 파생 된 설계 건설 기계 폐쇄 하 고 치유를 상처에 신속 하 게 그들의 잠재력에 대 한 의학에 구동된 상당한 관심을가지고. Fibrogenic 셀 문화에서 에 체 외에서 세포 외 매트릭스의 추출 임상 방해는 xenogeneic epitopes의 존재를 최소화 인간의-그리고 잠재적으로 환자 특정 셀 라인에서 ECM의 생성에 대 한 잠재력을가지고 일부 기존 ECM 제품의 성공입니다. ECM 이식 적합의 생체 외에서 생산에 중요 한 도전이 이다 ECM 생산 세포 배양에 의해 일반적으로 상대적으로 낮은 수익률의. 이 작품에서 셀 희생 빈 섬유 막 건설 기계 내에서 교양된으로 ECM의 생산에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 중공 사막은 fibroblast 세포 라인 전통적인 휴대 매체에 경작 그리고 ECM의 지속적인 스레드를 세포 배양 후 해산. 이 메서드에 의해 생성 결과 ECM 섬유 수 decellularized 고 동결 건조 된, 그것을 렌더링 하는 스토리지 및 이식에 적합.

Introduction

이식 외과 건설 기계는 상처 복구, 이식 복 벽 수리 혼자¹매년 전세계 1 백만 이상의 합성 폴리머 메시의 정착 물. 그러나, 합성 물질 중합체는 전통적으로 이러한 장비의 제조에 사용 되는 주입에 따라 하는 경향이 이물질 응답, 이식의 기능에 해로운 염증의 결과로 및 조직^{2의 흉터를 자극합니다} . 또한, 주된 합성 메시 물자 (즉, 폴 리 프로필 렌)는 몸에 의해 분명 리 모델링 하지, 그들은 일반적으로 흉터을 어디 용납 될 수 있다, 조직에 적용 가능한 치료의 방향으로 그들의 임상 유용성을 제한 고차 함수 근육 같은 조직. 많은 외과 메쉬 제품을 임상 성공으로 적용 된 반면, 최근 제조 업체 회상 합성 수술의 극대화 임 플 란 트의 중요성을 강조 하는 메쉬 및 interspecies 조직 이식의 합병증 생체 적합성, 수술에 대 한 규제를 강화 하는 FDA 라는 메쉬 제조 업체^3,4. 이식 환자 자신의 조직에서 파생 하는 장비의이 면역 반응을 감소 하지만 중요 한 기증자 사이트 사망률⁵에서 발생할 수 있습니다. 세포 외 기질 (ECM) 건설 기계 생산 체 외에 는 가능한 대안, decellularized ECM 건설 기계 전시 우수한 생체 적합성로 특히 헌 ECM의 경우 임 플 란 트⁶.

환자 조직 자가 이식에 대 한 수확의 한정 된 가용성 및 기증자 사이트에서 기능을 방해한의 위험, ECM 생산 능력을 생체 외에서 인간 세포 선의 문화에서 투어 또는, 만약에 가능 하다 면, 환자 자신의 셀 매력적인 대안 이다입니다. ECM에서 생체 외에서 의 상당한 금액의 제조에 있는 주요 과제는 이러한 어려운 캡처 분자의 격리. 이전 작품에서는, 우리는 증명 하고있다 ECM ECM 분 비 이식^7, decellularized 수 있는 수익률 ECM 문화 기간 후 해산는 희생 폴리머 폼에서 섬유 아 세포를 배양 하 여 생산 될 수 있다 ^8,,910. ECM 생산에 폼은 폼의 내부 아키텍처를 채택 하는 경향이, 빈 섬유 막 (HFMs) ECM의 생산을 위한 희생 발판으로 탐구 했다. 여기에 설명 된는 방법 주어 실험실 규모 세포 문화 품질 빈 섬유 막과 같은 섬유 문화의 기간 뒤에에서 대량 기질 섬유의 추출의 제조에 대 한. 이 정적 문화 방식은 쉽게 채택할 수 있는 실험실 표준 포유류 세포 배양 장비를 포함 하 여입니다. ECM이 접근이 방식에 의해 생산은 다양 한 임상 응용으로 적용할 수 있습니다.

Protocol

1. 희생 중공 사막은 사용 하 여 세포 외 매트릭스의 생산 주의: N-메 틸-2-pyrrolidone는 자극 용 매 및 생식 toxicant. NMP에 노출 피부, 눈, 코과 목에 자극을 일으킬 수 있습니다. NMP를 처리할 때 용 매 저항 개인 보호 장비를 사용 해야 합니다. NMP의 사용 연기 후드 내에서 수행 되어야 합니다. 중공 사막은 polysulfone 폴리머 솔루션의 준비 Polysulfone 펠 릿의 70…

Representative Results

희생 건설 기계에서 세포 외 매트릭스의 성공적인 생산은 적절 한 비 계 제조, 세포 배양, 그리고 용 린스 절차에 관 하 우발적 이다. 빈 섬유 막의 제조는 상용 철강의 환대를 통해 폴리머 솔루션의 돌출을 사용 하 여 상업적으로 사용 가능한 구성 요소 (그림 1)에서 조립 드라이-제트 젖은 회전 시스템을 사용 하 여 수행 spinneret (내부 직경 0.8 m m, 외경…

Discussion

설명 하는 프로세스의 대량 ECM 생체 재료에서 생체 외에서 중공 사막은 표준 셀 문화 장비 뿐만 아니라 세포 막의 저렴 한 대량 생산을 위한 수 있도록 드라이-제트 젖은 회전 시스템에 의해 캐스팅을 사용 하 여 생산 가능 이 프로토콜에서 조작 막 사용 하기 위한 세포 배양에서 하는 동안 설명 하는 시스템 또한 목적을 위해 분리, 기 공 크기 분포 및 빈 섬유 크기 가변 변화 하 여 막의 생산…

Materials

1/32 inch thick silicone rubber	Grainger	B01LXJULOM
20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable – VWR	VWR	66022-004	With attached white urea cap and cork foil liner
3 inch by 1 inch microscopy slides	VWR	75799-268
4C refrigerator	Thermo Fisher Scientific	FRGG2304D	Any commercial 4C refrigerator will suffice.
50 mL tubes	VWR	21008-178
6-well cell culture plates	VWR	10062-892	Alternative brands may be used
Acetone	VWR	E646	Alternative brands may be used
Bore vessel	McMaster-Carr	89785K867	6 ft 316 steel tubing
Bovine Plasma Fibronectin	Thermo Fisher Scientific	33010018	Comes as 1 mg of lyophilized protein
CaCl2	VWR/Amresco	97062-590
Cell Culture Incubator w/ CO2			Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice.
Disposable Serological Pipets, Glass – Kimble Chase	VWR	14673-208	Alternative brands may be used
DMEM/F-12, HEPES	Thermo Fisher Scientific	11330032	Warm in water bath at 37°C for 30 minutes prior to use
DNase I	Sigma-Aldrich	DN25-10MG
Dope vessel	McMaster-Carr	89785K867	6 ft 316 steel tubing
Ethanol	VWR	BDH1160	Dilute to 70% for sterilization
Fetal Bovine Serum, qualified, US origin – Gibco	Thermo Fisher Scientific	26140079	Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media)
Four 1/4-inch to 1" reducing unions	Swagelok	SS-1610-6-4	One reducing union for each inlet and outlet of each vessel
Freeze-dryer/lyophilizer	Labconco	117 (A65312906)	Any lyophilizer will suffice.
Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes – VWR	VWR	89106-752	Any weigh boat will suffice
Hollow fiber membrane immersion bath			34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets
Hollow Fiber Membrane Spinneret	AEI	http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html	Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm
Hot plate/stirrer	VWR	97042-634
Human TGF-β1	PeproTech	100-21
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544-25G
L-Ascorbic acid 2-phosphate	Sigma-Aldrich	A8960-5G
L-glutamine (200 mM) – Gibco	Thermo Fisher Scientific	25030081	Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media)
MgCl2	VWR/Alfa Aesar	AA12315-A1
Minus 80 Freezer	Thermo Fisher Scientific	UXF40086A	Any commercial -80C freezer will suffice.
N2 gas cylinders (two)
NIH/3T3 cells	ATCC	CRL-1658	Alternative fibrogenic cell lines may be used.
N-methyl-2-pyrrolidone	VWR	BDH1141	Alternative brands may be used
Penicillin/Streptomycin Solution – Gibco	Thermo Fisher Scientific	15140122	Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media)
Polysulfone	Sigma-Aldrich	428302	Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used
Portable Pipet-Aid Pipetting Device – Drummond	VWR	53498-103	Alternative brands may be used
PTFE tubing (1/4-inch inner diameter)	McMaster-Carr	52315K24	Alternative brands may be used.
Rat skeletal muscle fibroblasts			Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used.
RNase A	Sigma-Aldrich	R4642
Silicone sheet	McMaster-Carr	1460N28
Take-up motor	Greartisan	B071GTTSV3	200 RPM DC Motor
Tris HCl	VWR/Amresco	97063-756
Two needle valves	Swagelok	SS-1RS4