Produksjon av ekstracellulær Matrix fiber via oppofrende hul Fiber membran cellekultur
Summary
Målet med denne protokollen er produksjon av hele ekstracellulær matrix fiber mål for såret reparasjon som passer for prekliniske vurdering som en del av en regenererende stillaset implantat. Disse fibrene er produsert av kulturen i fibroblaster på hul fiber membraner og utdraget av oppløsningen av membraner.
Abstract
Foretatt stillaser avledet fra ekstracellulær matrix (EFM) har drevet interesse i medisin for sitt potensial i påskynde sår nedleggelse og helbredelse. Utvinning av ekstracellulær matrix fra fibrogenic celle kulturer i vitro har potensial for generering av ECM fra human- og potensielt pasient-spesifikke cellelinjer, minimere tilstedeværelsen av xenogeneic epitopes som har hindret klinisk suksessen til noen eksisterende ECM-produkter. En betydelig utfordring i vitro produksjon av ECM egnet for implantasjon er at ECM produksjon av cellekultur er vanligvis av relativt lav avkastning. I dette arbeidet, er protokoller beskrevet for produksjon av ECM av cellene kulturperler innen oppofrende hul fiber membran stillaser. Hul fiber membraner er kultivert med fibroblast linjer i et vanlig celle medium og oppløses etter cellekultur å gi kontinuerlig tråder av ECM. Den resulterende ECM fibrene produsert av denne metoden kan decellularized og lyofiliserte, gjengi det egnet for lagring og implantasjon.
Introduction
Implanterbare kirurgisk stillasene er et innslag av såret reparasjon, med over en million Syntetisk polymer nett implantert over hele verden hvert år for bukveggen reparasjon alene1. Imidlertid etter implantasjon syntetiske materialer polymerer tradisjonelt brukt i produksjon av disse stillaser pleier å provosere en fremmed kropp svar, noe som resulterer i betennelse skadelige for funksjonen til implantatet og arrdannelse av vev2 . Videre, som det dominerende syntetiske mesh materialet (dvs. polypropylen) ikke er merkbart remodeled av kroppen, de er generelt gjelder vev hvor arr kan tolereres, begrense klinisk nytten mot behandling av vev med høyere orden funksjoner som muskel. Mens det er mange kirurgiske maske produkter som har vært brukt med klinisk suksess, minnes siste produsenten av syntetiske kirurgiske masker og komplikasjoner fra Inter vev implantater markere betydningen av maksimere implantat biocompatibility, spørre FDA å stramme forskrift om kirurgiske maske produsenter3,4. Implantering av stillaser avledet fra pasientens eget vev reduserer denne immunrespons, men kan resultere i betydelige donor-områdes sykelighet5. Ekstracellulær matrix (EFM) stillaser produsert i vitro er et mulig alternativ, som decellularized ECM stillaser viser utmerket biocompatibility, spesielt når det gjelder autologous ECM implantater6.
På grunn av den begrensede tilgjengeligheten av pasienten vev å høste for autologous implantasjon og risikoen for hindrer funksjonen på donor-område, evnen til å produsere ECM stillaser i vitro fra kulturen i humane cellelinjer eller, hvis mulig, en pasient egne celler er et attraktivt alternativ. De største utfordringene i produksjon av betydelige mengder ECM i vitro er lagring av disse vanskelig å fange molekyler. I tidligere arbeid, har vi vist at ECM kan produseres av dyrking ECM-sekresjon fibroblaster i oppofrende polymere skum som oppløses etter kultur perioden til avkastning ECM som kan være decellularized for implantasjon7, 8,9,10. ECM produsert i skum tendens til å vedta den interne arkitekturen i skum, hul fiber membraner (HFMs) ble utforsket som en oppofrende stillaset for produksjon av tråder av ECM. Beskrevet her er metoder oppgave for lab skala produksjon av celle kultur kvalitet hul fiber membraner og utvinning av bulk ekstracellulær matrix fiber fra samme etter en periode av fibroblast kultur. Denne statiske kultur er lett adoptable laboratorier som inneholder standard pattedyr celle kultur utstyr. ECM produsert av denne tilnærmingen kan brukes mot en rekke kliniske applikasjoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Prosessene beskrives gjør at produksjonen av bulk ECM biologisk materiale i vitro med hul fiber membraner kastet av en tørr-jet våt spinning system slik at billige bulk produksjon av membraner som standard celle kultur utstyr. Selv membraner fabrikkert i denne protokollen er ment for bruk i cellekultur, kan systemet beskrevet også tilpasses for produksjon av membraner for separasjon formål, med pore størrelse distribusjon og hule fiber tunable av varierende spinneret dimensjoner, polymer brukes, dop og bar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningen i denne publikasjonen ble støttet av nasjonalt Institutt for Arthritis Musculoskeletal og hudsykdommer av National Institutes of Health prisen nummer R15AR064481, National Science Foundation (CMMI-1404716), samt Arkansas biovitenskap Instituttet.
Materials
| 1/32 inch thick silicone rubber | Grainger | B01LXJULOM | |
| 20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable – VWR | VWR | 66022-004 | With attached white urea cap and cork foil liner |
| 3 inch by 1 inch microscopy slides | VWR | 75799-268 | |
| 4C refrigerator | Thermo Fisher Scientific | FRGG2304D | Any commercial 4C refrigerator will suffice. |
| 50 mL tubes | VWR | 21008-178 | |
| 6-well cell culture plates | VWR | 10062-892 | Alternative brands may be used |
| Acetone | VWR | E646 | Alternative brands may be used |
| Bore vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Bovine Plasma Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010018 | Comes as 1 mg of lyophilized protein |
| CaCl2 | VWR/Amresco | 97062-590 | |
| Cell Culture Incubator w/ CO2 | Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice. | ||
| Disposable Serological Pipets, Glass – Kimble Chase | VWR | 14673-208 | Alternative brands may be used |
| DMEM/F-12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Warm in water bath at 37°C for 30 minutes prior to use |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25-10MG | |
| Dope vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Ethanol | VWR | BDH1160 | Dilute to 70% for sterilization |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media) |
| Four 1/4-inch to 1" reducing unions | Swagelok | SS-1610-6-4 | One reducing union for each inlet and outlet of each vessel |
| Freeze-dryer/lyophilizer | Labconco | 117 (A65312906) | Any lyophilizer will suffice. |
| Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes – VWR | VWR | 89106-752 | Any weigh boat will suffice |
| Hollow fiber membrane immersion bath | 34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets | ||
| Hollow Fiber Membrane Spinneret | AEI | http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html | Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm |
| Hot plate/stirrer | VWR | 97042-634 | |
| Human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | |
| L-glutamine (200 mM) – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media) |
| MgCl2 | VWR/Alfa Aesar | AA12315-A1 | |
| Minus 80 Freezer | Thermo Fisher Scientific | UXF40086A | Any commercial -80C freezer will suffice. |
| N2 gas cylinders (two) | |||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | Alternative fibrogenic cell lines may be used. |
| N-methyl-2-pyrrolidone | VWR | BDH1141 | Alternative brands may be used |
| Penicillin/Streptomycin Solution – Gibco | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media) |
| Polysulfone | Sigma-Aldrich | 428302 | Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used |
| Portable Pipet-Aid Pipetting Device – Drummond | VWR | 53498-103 | Alternative brands may be used |
| PTFE tubing (1/4-inch inner diameter) | McMaster-Carr | 52315K24 | Alternative brands may be used. |
| Rat skeletal muscle fibroblasts | Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used. | ||
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Silicone sheet | McMaster-Carr | 1460N28 | |
| Take-up motor | Greartisan | B071GTTSV3 | 200 RPM DC Motor |
| Tris HCl | VWR/Amresco | 97063-756 | |
| Two needle valves | Swagelok | SS-1RS4 |
References
- Cobb, W. S., Kercher, K. W., Heniford, B. T. The argument for lightweight polypropylene mesh in hernia repair. Surgical Innovation. 12 (1), 63-69 (2005).
- Morais, J. M., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. Biomaterials/Tissue Interactions: Possible Solutions to Overcome Foreign Body Response. The AAPS Journal. 12 (2), 188-196 (2010).
- Simon, P., et al. Early failure of the tissue engineered porcine heart valve SYNERGRAFT® in pediatric patients. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 23 (6), 1002-1006 (2003).
- . . FDA strengthens requirements for surgical mesh for the transvaginal repair of pelvic organ prolapse to address safety risks. , (2016).
- Kartus, J., Movin, T., Karlsson, J. Donor-site morbidity and anterior knee problems after anterior cruciate ligament reconstruction using autografts. Arthroscopy: The Journal of Arthroscopic & Related Surgery. 17 (9), 971-980 (2001).
- Lu, H., Hoshiba, T., Kawazoe, N., Chen, G. Autologous extracellular matrix scaffolds for tissue engineering. Biomaterials. 32 (10), 2489-2499 (2011).
- Wolchok, J. C., Tresco, P. A. The isolation of cell derived extracellular matrix constructs using sacrificial open-cell foams. Biomaterials. 31 (36), 9595-9603 (2010).
- Roberts, K., Schluns, J., Walker, A., Jones, J. D., Quinn, K. P., Hestekin, J., Wolchok, J. C. Cell derived extracellular matrix fibers synthesized using sacrificial hollow fiber membranes. Biomedical Materials. 13 (1), (2017).
- Hurd, S. A., Bhatti, N. M., Walker, A. M., Kasukonis, B. M., Wolchok, J. C. Development of a biological scaffold engineered using the extracellular matrix secreted by skeletal muscle cells. Biomaterials. 49, 9-17 (2015).
- Kasukonis, B. M., Kim, J. T., Washington, T. A., Wolchok, J. C. Development of an infusion bioreactor for the accelerated preparation of decellularized skeletal muscle scaffolds. Biotechnology Progress. 32 (3), 745-755 (2016).
- Murad, S., et al. Regulation of collagen synthesis by ascorbic acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (5), 2879-2882 (1981).
- Zhang, Y., et al. Tissue-specific extracellular matrix coatings for the promotion of cell proliferation and maintenance of cell phenotype. Biomaterials. 30 (23-24), 4021-4028 (2009).
- Feng, C. Y., Khulbe, K. C., Matsuura, T., Ismail, A. F. Recent progresses in polymeric hollow fiber membrane preparation, characterization and applications. Separation and Purification Technology. 111, 43-71 (2013).
- Domb, A. J., Kost, J., Wiseman, D. . Handbook of Biodegradable Polymers. , (1998).
