For zebrafisk er et modelsystem, der har mange værdifulde funktioner, herunder optisk klarhed, hurtige ekstern udvikling, og af særlig betydning for feltet af hørelse og balance, eksternt placeret sensoriske hårceller. Denne artikel beskriver hvordan transgene zebrafisk kan bruges til at analyse både hår-celle mechanosensation og præsynaptiske funktion i toto.
Sensoriske hårcellerne er mechanoreceptors fundet i det indre øre, der er nødvendige for hørelse og balance. Hår celler aktiveres i reaktion på sensoriske stimuli, der mekanisk aflede apikale fremspring kaldt hår bundter. Afbøjning åbner mechanotransduction (MET) kanaler i hår bundter, fører til en tilstrømning af kationer, herunder calcium. Denne kation tilstrømning depolarizes cellen og åbner spænding-gated calcium kanaler ligger basalt på hår-celle presynapse. I pattedyr, hårcellerne er indkapslet i knoglen, og det er udfordrende at funktionelt vurdere disse aktiviteter in vivo. Derimod larve zebrafisk er gennemsigtige og besidder en eksternt placeret laterale-line orgel, der indeholder hårceller. Disse hårcellerne er funktionelt og strukturelt svarer til pattedyr hårceller og kan være funktionelt vurderet in vivo. I denne artikel beskrives en teknik, der udnytter en genetisk kodet calcium indikator (GECI), signaler GCaMP6s, til at måle stimulus-fremkaldte calcium i zebrafisk laterale-line hårceller. GCaMP6s kan sammen med Konfokal imaging, bruges til at måle in vivo calciumsignaler på apex og base af laterale-line hårceller. Disse signaler giver en real-time, kvantificerbare udlæsning af både mechanosensation – og presynapse-afhængige calcium aktiviteter inden for disse hårceller. Disse calciumsignaler også give vigtige funktionelle oplysninger om hvordan hårceller registrere og transmittere sensoriske stimuli. Samlet set denne teknik genererer nyttige data om relative ændringer i calcium aktivitet in vivo. Det er mindre velegnet til kvantificering af absolut størrelsesklasse af calcium ændringer. Denne in vivo teknik er følsomme over for bevægelse artefakter. Et rimeligt beløb af praksis og dygtighed er nødvendige for korrekt positionering, immobilisering og stimulation af larver. I sidste ende, når korrekt udført, den protokol, der er beskrevet i denne artikel giver en kraftfuld måde at samle værdifulde oplysninger om aktiviteten af hårcellerne i deres naturlige, fuldt integreret stater inden for et levende dyr.
Funktionelle calcium imaging er et kraftfuldt værktøj, der kan bruges til at overvåge aktiviteten på mange celler samtidigt1. Især har calcium imaging ved hjælp af genetisk kodet calcium indikatorer (GECIs) vist sig at være fordelagtig, fordi GECIs kan udtrykkes i specifikke celletyper og lokaliseret subcellularly2. I neurovidenskab forskning, har disse funktioner gjort calcium imaging ved hjælp af GECIs en kraftfuld metode til både definere aktivitet mønstre inden for neuronal netværk og måle calcium tilstrømning på individuelle synapser3,4. Drage fordel af disse funktioner, en nylig undersøgelse bruges Konfokal mikroskopi og GECIs til at overvåge subcellulært aktivitet inden for samlinger af sensoriske hårceller5.
Hår celler er de mechanoreceptors, der registrerer lyd og vestibulære stimuli i det indre øre og lokale vandbevægelse i det laterale-line system i akvatiske vetebrates6,7. Hår celler er ofte mål for skader eller genetiske mutationer, der resulterer i den mest almindelige form for hørenedsættelse hos mennesker kendt som sensorineural hearing tab8,9. Derfor er det vigtigt at forstå, hvordan disse celler funktion for at forstå hvordan man kan behandle og forebygge høretab. For at fungere ordentligt, udnytte hårceller to specialiserede strukturer, der kaldes mechanosensory-hår bundter og synaptic bånd til at registrere og transmittere stimuli, henholdsvis. Hår bundter er placeret på toppen af hårcellerne og består primært af fine, hår-lignende fremspring kaldes stereocilia (fig. 1A). I vestibulære og laterale-line hårceller har hver hår bundle også en enkelt lang kinocilium (cellens eneste sande cilium), som kan udvide langt over stereocilia (fig. 1A). Mechanosensory stimuli aflede hår bundter, og afbøjning sætter spændingen på forbindelser kaldet “tip-links” at sammenkoble stereocilia10. Denne spænding åbner mechanotransduction (MET) kanaler ligger i stereocilia, hvilket resulterer i en apikale tilstrømning af kationer, herunder calcium11,12. Denne apikale aktivitet i sidste ende depolarizes håret cellen og åbner spænding-gated calcium kanaler (Cav1.3) i bunden af cellen. Cav1.3 kanaler findes ved siden af synaptic bånd, en præsynaptiske struktur, der bindsler vesikler på aktive zoner. Basal calcium tilstrømning gennem Cav1.3 kanaler er nødvendig for vesikel fusion, neurotransmission og aktivering af afferente neuroner13,14.
I mange år, elektrofysiologiske teknikker som helhed-celle patch fastspænding har været brugt til sonde de funktionelle egenskaber af hårcellerne i mange arter, herunder zebrafisk15,16,17, 18,19,20. Disse elektrofysiologiske optagelser har været særligt værdifulde i felterne hørelse og balance, fordi de kan bruges til at opnå yderst følsomme målinger fra individuelle sensoriske celler, hvis formål er at indkode ekstremt hurtig stimuli over en bred vifte af frekvenser og intensiteter21,22. Desværre, hele-celle optagelser kan ikke måle aktivitet af populationer af hårceller. For at studere aktivitet af populationer af celler i zebrafisk laterale-line, er microphonic potentialer og afferente handling potentialer blevet brugt til at måle den summerede mechanosensitive og postsynaptiske respons egenskaber af individuelle neuromasts23 ,24. Desværre har hverken hele-celle optagelser eller lokale potentielle feltmålinger den rumlige opløsning at lokalisere hvor aktivitet foregår inden for enkelte celler eller måler aktiviteten af hver celle i en befolkning. Mere nylig, calcium farvestoffer og GECIs har været ansat til at omgå disse udfordringer25,26.
I zebrafisk, har GECIs vist sig for at være en kraftfuld tilgang til behandlingen af hår-celle funktion på grund af den relativt let at skabe transgene zebrafisk og den optisk klarhed af larver27. På zebrafisk larver der hårcellerne i det indre øre samt laterale-line system. Sidelinjen består af roset-lignende klynger af hår celler kaldet neuromasts, der bruges til at registrere lokale ændringer i vandbevægelse (figur 1). Sidelinjen er især nyttigt, fordi det ligger eksternt langs overfladen af fisken. Denne adgang har gjort det muligt at stimulere hårcellerne og måle calciumsignaler optisk i intakt larver. Lethed, hvormed transgenese, gennemsigtighed af larver, og laterale-line hårceller uovertruffen adgang har generelt gjort zebrafisk en uvurderlig model til at studere aktiviteten af hår celler in vivo. Dette er en betydelig fordel i forhold til pattedyr systemer som hår celler er omgivet af benede strukturer i det indre øre. Denne manglende adgang har gjort det meget vanskeligt at erhverve funktionelle in vivo målinger af pattedyr hårceller.
Protokollen skitseret her beskriver hvordan man kan overvåge MET kanal – og presynapse-afhængige ændringer i calcium inden for enkelte hårceller og mellem celler inden for neuromasts i larve zebrafisk. Denne protokol udnytter en etableret transgene zebrafisk linje, der udtrykker en membran-lokaliseret GCaMP6s under kontrol af hår-celle specifikke myosin6b promotor28. Denne membran lokalisering holdninger GCaMP6s for at opdage calcium tilstrømning gennem Ionkanaler placeret i plasma membran, der er afgørende for hår-celle funktion. For eksempel, membran-lokaliseret GCaMP6s kan afsløre calcium tilstrømning gennem MET kanaler i apikale hår bundter og gennem CaV1,3 kanaler nær synaptic bånd i bunden af cellen. Dette er i kontrast med hjælp af GECIs lokaliseret i cytosol, som cytosole GECIs opdage calciumsignaler, der er en kombination af markedsøkonomisk behandling og CaV1,3 kanal aktivitet samt calcium bidrag fra andre kilder (f.eks., store udgivelse). Denne protokol beskriver, hvordan at immobilisere og lamme GCaMP6s transgene larver inden billeddannelse. Derefter beskrives det hvordan du forbereder og bruge en væske-jet til at aflede hår bundter for at stimulere laterale-line hårcellerne i en kontrolleret og reproducerbar måde. Præsenteres repræsentative data, der kan opnås ved hjælp af denne protokol. Eksempler på data, der repræsenterer bevægelsen artefakter er også præsenteret. Kontrol eksperimenter, der bruges til at kontrollere resultaterne og udelukke artefakter er beskrevet. Endelig, en metode til at visualisere rumlige calciumsignaler i Fiji software er beskrevet. Denne Fiji analyse er tilpasset fra tidligere etablerede visualisering metoder udviklet ved hjælp af MATLAB5. Samlet set skitserer denne protokol en kraftfuld forberedelse teknik, som anvender GECIs larve zebrafisk at måle og visualisere hår-celle calcium dynamics in vivo.
In vivo billeddannelse i intakte dyr er i sagens natur udfordrende. Flere trin i denne metode er afgørende for at indhente pålidelige i vivo målinger af calcium fra laterale-line hårceller. For eksempel, er det meget vigtigt, at larve er fastgjort og lammet ordentligt før imaging for at minimere bevægelse under imaging. Overskydende bevægelse under imaging kan føre til ændringer i GCaMP6s fluorescens, der er ikke rigtigt signaler og svarer ikke til ændringer i calcium niveauer (f.eks. tal 4B1′-B1” og 4 C 1′-C1”). Hale pins kan placeres flere anteriorly til at hjælpe med at minimere bevægelse, selvom det kan gøre mere posterior neuromasts utilgængelige. Efter injektion af hjertet, kan der desuden drejes et hoved pins, således at den vandrette del af pin ligger på tværs af blommesækken. Ud over at ændre placeringen af pins, er det også muligt at bruge en hjerne-skive harpe i stedet for nåle til at immobilisere larver34. Når det placeres over larverne korrekt, er en harpe et supplerende, potentielt mindre invasiv metode til at immobilisere larver. Mens betydelig bevægelse kan skyldes utilstrækkelig fastgørelse, kan manglende korrekt udføre hjerte injektion for at levere α-bungarotoxin og lamme larver resultere i ufuldstændig lammelse, bevægelse, og i sidste ende bevægelse artefakter. Selv om anvendte anæstetika har vist sig at påvirke ophidselse af zebrafisk hårceller, har seneste arbejde vist, at den bedøvende benzocain ikke forstyrrer mange aspekter af hår-celle aktivitet. På samme måde, mere almindeligt anvendte bedøvelsesmiddel MS-222 kun griber ind i visse aspekter af hår-celle aktivitet15. Derfor, på grund af de udfordrende karakter af α-bungarotoxin injektion, benzocain eller MS-222 ansøgning kan vise sig for at være et nyttigt alternativ metode til lammelse at forhindre bevægelse i larve under funktionelle calcium imaging.
Ud over de tekniske udfordringer i denne protokol er selv en perfekt monteret prøve ubrugelige, hvis larve og hår celler ikke er sundt, før og under hver tænkelig eksperiment. For at sikre, at larver og hårceller er sundt, er det vigtigt, at larver er fastholdt i E3 buffer, der er fri for snavs som chorions (æggeskaller), affald og mikroorganismer. Selv om den overfladiske placering af laterale-line hårcellerne er fordelagtige for billedbehandling, denne beliggenhed gør dem mere sårbare over for cellulære skader når E3 buffer er forurenet. En ren, vandige miljø er særlig vigtigt for unge larver (2-4 dpf) eller mutanter, der ikke kan opretholde en opretstående svømning position og primært ligge på bunden af petriskålen. I disse situationer, kan laterale-line hårceller og beskyttende cupula omkring hår bundter nemt blive kompromitteret. Selv når du starter med sunde larver og hårceller, i løbet af hvert forsøg, er det afgørende at sikre, at larve har et hjerteslag og hurtige blodgennemstrømning. Hvis blodgennemstrømningen bremser eller stopper, kan blive kompromitteret af hårcellerne sundhed. I kompromitteret forberedelserne involverer usunde larver eller tab af blodgennemstrømningen, døende hårceller kan identificeres på flere måder: første, ved udseendet af karyopyknosis eller nukleare kondens, som manifesterer sig som en boble i cellen under DIC optik; for det andet af celle svind og forekomst af hurtigt flytte partikler i cytoplasmaet; og tredjedel, når kinocilia tips splay i forskellige retninger35. Når hår bundter er afbrudt, den spredte kinocilia ikke flytte fasthed sammen under stimulation.
Dette præparat har flere mindre begrænsninger, nemlig at præparatet kun forbliver robust for 1-3 timer efter det er etableret. Ændringer som ved hjælp af mindre stifter eller en hjerne-skive harpe til at immobilisere larver og tilføje en perfusion system kan forlænge levetiden for denne i vivo forberedelse. En anden begrænsning er, at photobleaching og fototoksicitet kan forekomme efter gentagen imaging forsøg. En spændende måde at overvinde denne udfordring er at tilpasse denne protokol til lys-ark mikroskopi. Lys-ark mikroskopi er en kraftfuld måde at reducere ud af fokus lys, hvilket fører til mindre photobleaching og fototoksicitet36. Sammen, kan blidere immobilisering og mindre foto-eksponering hjælpe forlænge hver tænkelig session. Længere imaging sessioner kan bruges til at undersøge den fulde varighed af funktionelle ændringer ledsager udvikling og processer underliggende hår-celle clearance og regeneration efter skade. Det er vigtigt at påpege, at, ud over lys-ark mikroskopi, denne protokol kan tilpasses andre typer Konfokal systemer (punkt-scanning, 2-foton og spinning disk) og relativt enkle widefield systemer28,34 . Samlet set gør sin alsidighed denne protokol et værdifuldt redskab, der kan tilpasses og bruges med flere Billeddannende systemer.
Mens denne protokol kan tilpasses og bruges med mange Billeddannende systemer, kan dele af denne protokol også tilpasses og anvendes (1) med andre indikatorer ud over GCaMP6s og (2) til billedet aktivitet i andre sensoriske celler og neuroner i larve zebrafisk. For eksempel, i en tidligere undersøgelse brugte vi denne protokol til billede aktivitet af flere genetisk kodet indikatorer inden for laterale-line hårceller til påvisning af cytosole calcium (RGECO1), vesikel fusion (SypHy), membran spænding (Bongwoori) og membran calcium (jRCaMP1a-caax og GCaMP6s-caax), og inden for laterale-line afferente processer til at opdage membran calcium (GCaMP6s-caax)5. Baseret på vores erfaring med at bruge disse indikatorer, tilbyder den transgene linje Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) beskrevet i denne protokol en fremragende start for imaging aktivitet i laterale-line neuromasts. Af alle de indikatorer, der er anført ovenfor, har vi fundet, at GCaMP6s er den mest følsomme og photostable. Ud over disse funktioner, vi fremhæve Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) transgene linje, fordi det kan bruges til at lave to forskellige målinger: hår-celle mechanosensation og præsynaptiske calcium inden for en enkelt transgene linje.
Den teknik, der er beskrevet i denne artikel viser, hvordan calcium imaging i sidelinjen zebrafisk kan være en kraftfuld metode til at studere, hvordan hårceller fungere i deres oprindelige miljø. Denne tilgang er et supplement til studier af pattedyr i hvilken hår-celle funktion er i øjeblikket undersøgt i ex vivo explants. Desuden kan zebrafisk model fortsat anvendes som en platform til at afprøve effekten af genetisk kodet indikatorer, der kan derefter anvendes til at undersøge aktivitet i pattedyrceller hår.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NIH/NIDCD murene forskning midler 1ZIADC000085-01 (K.S.K.). Vi vil gerne anerkende Candy Wong for hendes hjælp i at skrive makroen Fiji. Vi vil også gerne takke Doris Wu og Candy Wong for deres hjælpsomme forslag med protokollen.
Section 1 | |||
α-Bungarotoxin | R&D Systems | 2133 | For paralyzing larvae prior to imaging |
Phenol red Solution 0.5% | Sigma-Aldrich | P0290 | For visualization of α-bungarotoxin solution during heart injection |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB, MS-222, tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | For anesthetizing larvae |
Section 2 | |||
Imaging chamber | Siskiyou | PC-R | Platform to mount larvae for imaging |
No. 1.5 Coverslips square, 22*22 mm | VWR | 48366-227 | To seal imaging chamber |
High vacuum silicone grease | Fischer Scientific | 14-635-5D | For affixing of coverslip to imaging chamber |
Silicone encapsulant clear 0.5 g kit | Ellsworth Adhesives | Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | To fill imaging chamber to create a surface to pin fish |
Oven | Techne | HB-1D | For drying silicone encapsulant |
Stereomicroscope | Carl Zeiss Microscopy | Stemi 2000 with transmitted light illumination | For illuminating wire, forceps and scissors to make pins |
Fine forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 | For making pins |
Fine scissors | Cole-Palmer | 5.5", EW-10818-00 | For cutting tunsgten wire to make pins |
Tungsten wire, 0.035 mm | Goodfellow | W005131 | For head pins to immobilize larvae |
Tungsten wire, 0.025 mm | ThermoFischer Scientific | AA10405-H4 | For tail pins to immobilize larvae |
Section 3 | |||
Micropipette guller | Sutter Instrument Company | P-97 | For pulling capillary glass for fluid-jet and heart injection needles |
Borosilicate glass capillaries w/ filament | Sutter Instrument Company | BF 150-86-10 | Glass to be pulled into α-bungarotoxin injection needles for heart injection |
Borosilicate glass capillaries w/o filament | Sutter Instrument Company | B 150-86-10 | Glass to be pulled into fluid-jet needles to stimulate hair cells |
Pipette polisher | Narishige | MF-830 microforge | To polish fluid-jet pipette tips to smooth jagged breaks |
Ceramic tile | Sutter Instrument Company | NC9569052 | For scoring and evening breaking fluid-jet needles |
Sections 4 & 5 | |||
Fine forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 | For pinning larvae |
Gel loading tips | Eppendorf | 5242956003 | For backfilling heart injection needles |
Stereomicroscope | Carl Zeiss Microscopy | Stemi 2000 with transmitted light illumination | For illuminating larvae during pinning and heart injection |
Glass capillary/needle holder | WPI | MPH315 | To hold fluid-jet needles |
Manual micromanipulator | Narishige | M-152 | For holding and positioning of needle holder to inject α-bungarotoxin |
Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | For holding manual micromanipulator for α-bungarotoxin injection |
Pressure injector | Eppendorf | Femtojet 4x | To deliver α-bungarotoxin |
Sections 6, 7 & 8 | |||
Confocal microscope | Bruker | Swept field/Opterra confocal microscope | Fixed, upright microscope with DIC optics and 488nm laser with appropriate filters |
Microscope software | Bruker | Prairieview 5.3 | To coordinate and control the microscope, lasers, stage, piezo-z, cameras and fluid jet |
10X air objective | Nikon | MRH00101 | Low magnification for positioning of larvae and fluid jet |
60X water objective | Nikon | MRF07620 | Water immerison objective with high NA (1.0) and adequate working distance (2.0 mm) |
Piezo-Z objective scanner with controller/driver | Physik Intruments instruments/Bruker | 01144210/UM-Z-PZ | High-speed z-stack acquisition with 0.025um accuracy |
EMCCD camera | QImaging | Rolera EM-C2 EMCCD camera | Camera with small pixel size that can acquire up to 100 frames per s |
Circular chamber adapter | Siskiyou | PC-A | For holding and rotating imaging chamber on microscope stage |
Motorized Z-deck stage | Prior Scientific | ZDN12MP | Microscope stage that can hold and move sample and micromanipulator with fluid-jet needle together |
Z-deck stage insert adaptor | NIH Machine shop | custom | To fit the circular chamber adaptor onto the z-deck stage |
Fluid-jet apparatus | ALA scientific instruments | HSPC-1 High-speed pressure Clamp with PV-PUMP | For controlling and delivering the fluid-jet stimulus |
Masterflex Peroxide-cured silicone tubing (1 ft) | Cole-Palmer | Masterflex L/S 13, 96400-13 | For connecting the fluid-jet needle holder to pressure pump |
Motorized micromanipulator | Sutter Instrument Company | MP-225 | For holding and positioning of needle holder for fluid jet |
Micromanipulator controller | Sutter Instrument Company | MPC-200 | For controlling fluid-jet needle manipulator |
Gel loading tips | Eppendorf | 5242956003 | For backfilling fluid-jet needles |
Glass capillary/needle holder | WPI | MPH315 | To hold fluid-jet needles |
PSI manometer | Sper Scientific | 840081 | For measuring pressure clamp output |
Section 9 | |||
BAPTA, Tetrapotassium Salt, cell impermeant | ThermoFischer Scientific | B1204 | To cleave tips links, uncouple MET channels and block all evoked GCaMP6s signals |
Isradipine | Sigma-Aldrich | I6658 | To block signals dependent on the L-type calcium channels (CaV1.3) at the presynapse |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Solvent for pharmacological compounds |
Section 10 | |||
Prism7 | Graphpad | Prism7 | Software to plot GCaMP6 intensity changes |
FIJI | Schindelin, et., al.34 | https://fiji.sc/ | Software to process images and create spatio-temporal signal maps |
Turboreg Plugin | Thévenaz et., al.29 | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI |
StackReg Plugin | Thévenaz et., al.29 | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ | Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI |
Times Series Analyzer V3 Plugin | Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html | Plugin to create multiple ROIs to measure GCaMP6 intensity changes |