Sebrafisk er en modell som har mange verdifulle funksjoner inkludert optisk klarhet, raske eksterne utviklingen, og spesielt viktig å høre og balanse, eksternt ligger sensoriske hårcellene. Denne artikkelen beskriver hvordan transgene sebrafisk kan brukes til analysen både hår-cellers mechanosensation og presynaptic-funksjonen i toto.
Sensorisk hårcellene er mechanoreceptors i det indre øret som er nødvendig for hørsel og balanse. Hårcellene aktiveres svar på sensoriske stimuli som mekanisk avlede apikale utstikkende deler kalt hår bunter. Nedbøyning åpner mechanotransduction (MET) kanaler i hår bunter, fører til en strøm av kasjoner, inkludert kalsium. Denne kasjon pågangen depolarizes cellen og åpner spenning-gated kalsium kanaler ligger basally på hår-celle presynapse. I pattedyr, hårcellene er omsluttet i ben og det er utfordrende å funksjonelt vurdere disse aktivitetene i vivo. Derimot larver sebrafisk er transparent og ha et eksternt ligger sidelinjen organ som inneholder hårcellene. Disse hårcellene er funksjonelt og strukturelt ligner på pattedyr hårcellene og kan være funksjonelt vurdert i vivo. Denne artikkelen beskriver en teknikk som bruker en genetisk kodet kalsium indikator (GECI), signaler GCaMP6s, måle stimulans-utløste kalsium i sebrafisk sidelinjen hårcellene. GCaMP6s kan brukes sammen med AC confocal imaging, måle i vivo kalsium signaler på toppen og bunnen av lateral linje hårcellene. Disse signalene inneholder en real-time, målbare avlesning av både mechanosensation – og presynapse-avhengige kalsium aktiviteter innenfor disse hårcellene. Disse kalsium signalene også gi viktige funksjonelle informasjon om hvordan hårcellene oppdage og overføre sensoriske stimuli. Total, denne teknikken genererer nyttige data om relativ endringer i kalsium aktivitet i vivo. Det er mindre velegnet for kvantifisering av absolutt omfanget av kalsium endringer. Denne i vivo teknikken er følsom for bevegelse. En rimelig andel av praksis og ferdigheter er nødvendig for riktig posisjonering, immobilisering og stimulering av larver. Til slutt, når godt utført, protokoll beskrevet i denne artikkelen gir en kraftfull måte å samle verdifull informasjon om aktiviteten av hårcellene i deres naturlige, fullt integrert delstater levende dyr.
Funksjonell kalsium bildebehandling er et kraftig verktøy som kan brukes til å overvåke aktiviteten til mange celler samtidig1. Spesielt har kalsium bildevisning genetisk kodet kalsium indikatorer (GECIs) vist å være en fordel fordi GECIs kan uttrykkes i spesifikke celletyper og lokaliserte subcellularly2. I nevrovitenskap forskning, har disse funksjonene gjort kalsium bildevisning GECIs en kraftig metode for både definere aktivitet mønstre i nevrale nettverk og måle kalsium tilstrømningen personlige synapser3,4. Dra nytte av disse funksjonene, en fersk studie brukt AC confocal mikroskopi og GECIs for å overvåke subcellular aktivitet innen samlinger av sensoriske hårcellene5.
Hårcellene er mechanoreceptors som oppdager lyd og vestibular stimuli i indre øret og lokale vann bevegelse i sidelinjen systemet i akvatiske vetebrates6,7. Hårcellene er ofte målet for skade eller genetiske mutasjoner som resulterer i den vanligste typen hørselstap hos mennesker kjent som sensorineural hørselen tap8,9. Derfor er det avgjørende å forstå hvordan disse cellene funksjon for å forstå hvordan å behandle og forebygge hørselstap. For å fungere skikkelig, benytte hårcellene to spesialiserte strukturer kalles mechanosensory-hår bunter og synaptic bånd å oppdage og overføre stimuli, henholdsvis. Hår bunter ligger på toppen av hårcellene og består hovedsakelig av fine, hår-lignende utstikkende deler kalt stereocilia (figur 1A). Vestibular og sidelinjen hårcellene har hver håret bunt også en enkelt lang kinocilium (cellens eneste sanne Flimmerhår), som kan strekke seg langt over stereocilia (figur 1A). Mechanosensory stimuli avlede hår bunter, og nedbøyning setter spenning på sammenhengene kalt “tips-koblinger” som interconnect stereocilia10. Denne spenningen åpner mechanotransduction (MET) kanaler ligger i stereocilia, noe som resulterer i en apikale tilstrømning av kasjoner, inkludert kalsium11,12. Denne apikale aktiviteten til slutt depolarizes hår cellen og åpner spenning-gated kalsium kanaler (Cav1.3) på bunnen av cellen. Cav1.3 kanaler finnes tilstøtende synaptic bånd, en presynaptic struktur som tethers blemmer på aktive soner. Basal kalsium tilstrømningen gjennom Cav1.3 kanaler kreves for vesicle fusion, neurotransmission og aktivering av afferente neurons13,14.
I mange år, har elektrofysiologiske teknikker som helhet celle oppdateringen clamping brukt å undersøke funksjonelle egenskaper hårcellene i mange arter, inkludert sebrafisk15,16,17, 18,19,20. Elektrofysiologiske opptakene er spesielt verdifull i feltene høring og balanse fordi de kan brukes til å få ekstremt følsomme målinger fra personlige sensoriske celler, hvis formål er å kode ekstremt rask stimuli over en bredt spekter av frekvenser og intensiteter21,22. Dessverre, hele celler opptak kan ikke måle aktiviteten til bestander av hårcellene. For å studere aktiviteten til bestander av celler i sebrafisk-sidelinjen, har microphonic potensialer og afferente handling potensialer brukt til å måle summerte mechanosensitive og postsynaptic svar egenskapene for individuelle neuromasts23 ,24. Dessverre, verken hele celle opptak eller lokale feltet potensielle mål har romlig oppløsning å finne hvor aktiviteten skjer i enkeltceller eller måle aktiviteten i hver celle i en populasjon. Flere nylig, kalsium fargestoffer og GECIs har vært ansatt å omgå disse utfordringene25,26.
I sebrafisk, har GECIs vist seg for å være en effektiv tilnærming til å undersøke hår-celle-funksjonen på grunn av det er relative enkelt å lage transgene sebrafisk og optisk klarhet Larvene27. I sebrafisk Larvene er hårcellene tilstede i det indre øret, samt sidelinjen systemet. Sidelinjen består av rosett-lignende klynger av hårcellene kalt neuromasts som brukes til å oppdage lokale endringer i vann bevegelse (figur 1). Sidelinjen er spesielt nyttig fordi det ligger eksternt langs overflaten av fisken. Dette har gjort det mulig å stimulere hårvekst celler og måle kalsium signaler optisk i intakt larver. Total, enkel transgenesis, gjennomsiktighet næringsplante og enestående tilgang sidelinjen hårcellene har gjort sebrafisk en uvurderlig modell å studere aktiviteten til hårcellene i vivo. Dette er en betydelig fordel i forhold til pattedyr systemer der hårcellene er omgitt av benete strukturer i det indre øret. Denne mangelen på tilgang har gjort det svært vanskelig å skaffe funksjonelle i vivo målinger av hår pattedyrceller.
Protokollen skissert her beskriver hvordan å overvåke MET kanal – og presynapse-avhengige endringer i kalsium i enkeltceller hår og blant celler innenfor neuromasts i larver sebrafisk. Denne protokollen bruker en etablert transgene sebrafisk linje som uttrykker en membran-lokalisert GCaMP6s under kontroll av hår-celle bestemte myosin6b promoter28. Denne membranen lokalisering stillinger GCaMP6s for å oppdage kalsium tilstrømningen gjennom ionekanaler i plasma membranen som er avgjørende for håret-celle-funksjonen. For eksempel membran-lokalisert GCaMP6s finner kalsium tilstrømningen gjennom MET kanaler i apikale hår bunter og gjennom CaV1.3 kanaler nær synaptic bånd på bunnen av cellen. Dette gir kontrast til bruker GECIs lokalisert på stoffer som cytosolic GECIs oppdager kalsium signaler som er en kombinasjon av MET og CaV1.3 kanal aktivitet samt kalsium bidrag fra andre kilder (f.eks, store release). Denne protokollen skisserer hvordan nakkens og lamme GCaMP6s transgene Larvene før bildebehandling. Det beskriver hvordan du forbereder og bruke en væske-jet for å avlede hår pakker for å stimulere sidelinjen hårcellene i en kontrollert og reproduserbar måte. Representant data som kan oppnås ved hjelp av denne protokollen presenteres. Eksempler på data som representerer bevegelse gjenstander er også presentert. Kontroll eksperimenter som brukes til å bekrefte resultatene og utelukke gjenstander er beskrevet. Til slutt, en metode for å visualisere romlige kalsium signaler i Fiji programvaren er beskrevet. Fiji analysen er tilpasset fra tidligere etablert visualisering metoder utviklet ved hjelp av MATLAB5. Samlet skisserer denne protokollen en kraftig forberedelse teknikk som bruker GECIs larver sebrafisk å måle og visualisere hår-celle kalsium dynamikken i vivo.
I vivo imaging i intakt dyr er iboende utfordrende. Flere trinn i denne metoden er avgjørende for å oppnå pålitelige i vivo kalsium målinger fra sidelinjen hårcellene. For eksempel er det svært viktig at larvene er låst og lammet riktig før å minimere bevegelse under bildebehandling. Overflødig bevegelse under bildebehandling kan føre til endringer i GCaMP6s fluorescens som ikke sant signaler og ikke samsvarer med endringer i kalsium nivåer (f.eks tall 4B1′-B1” og 4 C 1′-C1”). Hale pinner kan plasseres mer peke for å minimere bevegelse, men dette kan gjøre mer bakre neuromasts utilgjengelig. Videre etter hjertet injeksjon, kan hodet pinner roteres slik at den vannrette delen av pin ligger over eggeplomme. I tillegg til å endre plasseringen av pinner, er det også mulig å bruke en hjerne-skive harpe i stedet for pinner for å nakkens Larvene34. Når det plasseres over Larvene riktig, er en harpe en ekstra, potensielt mindre invasiv metode for immobilizing larver. Mens betydelig bevegelse kan skyldes utilstrekkelig låsing, kan riktig utføre hjertet injeksjon å levere α-bungarotoxin og lamme Larvene resultere i ufullstendige lammelse, bevegelse, og til slutt bevegelse gjenstander. Selv om brukte bedøvelse har blitt vist å påvirke excitability av sebrafisk hårcellene, har siste arbeid vist at det anesthetic benzocaine ikke påvirke mange aspekter av hair celle aktivitet. Tilsvarende vanlig mer bedøvelse MS-222 bare forstyrrer visse aspekter av hair celle aktivitet15. Derfor grunn utfordrende av α-bungarotoxin injeksjon, benzocaine eller MS-222 program kan vise seg for å være en nyttig alternativ lammelse å forhindre bevegelse i Larven under funksjonelle kalsium bildebehandling.
De tekniske utfordringene involvert i denne protokollen er selv en perfekt montert prøven ubrukelig hvis den Larven og hårcellene ikke er sunt før og under hver tenkelig eksperiment. For å sikre at larvene og hårcellene er sunn, er det viktig at larvene er opprettholdt i E3 buffer som er fri for rusk som chorions (egg skall), avfall og mikroorganismer. Selv om overfladiske plasseringen av lateral linje hårcellene er fordelaktig for bildebehandling, gjør beliggenheten dem mer utsatt for cellular skade når E3 bufferen er fouled. Et rent miljø for vandige er spesielt viktig for unge larver (2-4 dpf) eller mutanter som ikke kan opprettholde en oppreist svømming plasser og primært ligger på bunnen av Petriskål. I disse situasjonene kan sidelinjen hårcellene og beskyttende Cúpula rundt hår pakker lett bli svekket. Selv når starter med sunn larver og hårcellene i løpet av hver eksperimentet, er det viktig å sikre at larvene har hjerteslag og rask blod flyte. Hvis blodstrøm bremser eller stopper, kan helse hårcellene bli svekket. I utsatte preparater usunn larver eller tap av blodstrøm, døende hårcellene kan identifiseres på flere måter: først av utseendet på karyopyknosis eller kjernefysiske kondens, som manifesterer seg som en boble i cellen under DIC optikk; andre av cellen krymping og tilstedeværelsen av raskt flytte partikler i cytoplasma; og tredje, når kinocilia tips splay i forskjellige retninger35. Når håret bunt er forstyrret, flyttes ikke den sprikende kinocilia kontinuerlig sammen under stimulering.
Dette preparatet har flere mindre begrensninger, en er at forberedelsene bare forblir robust for 1-3 timer etter den er opprettet. Endringer som benytter mindre pinner eller en hjerne-bit terpe til nakkens larver og legge et perfusjon system kan forlenge levetiden til dette i vivo preparatet. En annen begrensning er at photobleaching Phototoksisitet kan oppstå etter at gjentatt imaging studier. En spennende måte å mestre denne utfordringen er å tilpasse denne protokollen for lys arks mikroskopi. Lys arks mikroskopi er en effektiv måte å redusere av fokus lys, fører til mindre photobleaching og Phototoksisitet36. Sammen kan mildere immobilisering og mindre Foto-eksponering hjelpe forlenge hver tenkelig økt. Lenger tenkelig økter kan brukes til å undersøke hele varigheten til funksjonelle endringer følger utviklingen og prosessene underliggende hår-celle klarering og regenerasjon etter skade. Det er viktig å påpeke at i tillegg til lys arks mikroskopi, denne protokollen kan tilpasses andre typer AC confocal systemer (punkt-skanning, 2-fotonet og spinning disk) og relativt enkle widefield systemer28,34 . Total, dens allsidighet gjør dette protokollen et verdifullt verktøy som kan tilpasses og brukes med flere imaging-systemer.
Mens denne protokollen kan tilpasses og brukes med mange imaging-systemer, kan deler av denne protokollen også tilpasses og brukes (1) med andre indikatorer foruten GCaMP6s og (2) bildet aktivitet i andre sensoriske celler og nerveceller i larver sebrafisk. For eksempel i en tidligere studie brukte vi denne protokollen til bildet aktivitet bruker flere genetisk kodet indikatorer innenfor sidelinjen hårcellene for å oppdage cytosolic kalsium (RGECO1), vesicle fusion (SypHy), membran spenning (Bongwoori) og membran kalsium (jRCaMP1a-caax og GCaMP6s-caax), og sidelinjen afferente prosesser å oppdage membran kalsium (GCaMP6s-caax)5. Basert på vår erfaring med disse indikatorene, gir transgene linjen Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) beskrevet i denne protokollen en utmerket start på imaging aktivitet i sidelinjen neuromasts. Alle indikatorer ovenfor, har vi funnet at GCaMP6s er de mest sensitive og photostable. I tillegg til disse funksjonene vi markere Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) transgene linjen fordi det kan brukes å lage to forskjellige målinger: hår-cellers mechanosensation og presynaptic kalsium i transgene enkeltlinjer.
Teknikken beskrevet i denne artikkelen viser hvordan kalsium imaging i sidelinjen sebrafisk kan være en kraftig metode å studere hvordan hårcellene fungerer i sitt eget miljø. Denne tilnærmingen er utfyllende til studier av pattedyr i hvilken hår-celle funksjonen studeres i ex vivo explants. I tillegg kan sebrafisk modell fortsette å bli brukt som en plattform for å teste effekten av genetisk kodet indikatorer som kan deretter brukes til å undersøke aktiviteten i pattedyrceller hår.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIH/NIDCD intramural forskning midler 1ZIADC000085-01 (K.S.K.). Vi ønsker å erkjenne Candy Wong for henne hjelp i å skrive makroen Fiji. Vi vil også gjerne takke Doris Wu og Candy Wong for deres forslag med protokollen.
Section 1 | |||
α-Bungarotoxin | R&D Systems | 2133 | For paralyzing larvae prior to imaging |
Phenol red Solution 0.5% | Sigma-Aldrich | P0290 | For visualization of α-bungarotoxin solution during heart injection |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB, MS-222, tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | For anesthetizing larvae |
Section 2 | |||
Imaging chamber | Siskiyou | PC-R | Platform to mount larvae for imaging |
No. 1.5 Coverslips square, 22*22 mm | VWR | 48366-227 | To seal imaging chamber |
High vacuum silicone grease | Fischer Scientific | 14-635-5D | For affixing of coverslip to imaging chamber |
Silicone encapsulant clear 0.5 g kit | Ellsworth Adhesives | Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | To fill imaging chamber to create a surface to pin fish |
Oven | Techne | HB-1D | For drying silicone encapsulant |
Stereomicroscope | Carl Zeiss Microscopy | Stemi 2000 with transmitted light illumination | For illuminating wire, forceps and scissors to make pins |
Fine forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 | For making pins |
Fine scissors | Cole-Palmer | 5.5", EW-10818-00 | For cutting tunsgten wire to make pins |
Tungsten wire, 0.035 mm | Goodfellow | W005131 | For head pins to immobilize larvae |
Tungsten wire, 0.025 mm | ThermoFischer Scientific | AA10405-H4 | For tail pins to immobilize larvae |
Section 3 | |||
Micropipette guller | Sutter Instrument Company | P-97 | For pulling capillary glass for fluid-jet and heart injection needles |
Borosilicate glass capillaries w/ filament | Sutter Instrument Company | BF 150-86-10 | Glass to be pulled into α-bungarotoxin injection needles for heart injection |
Borosilicate glass capillaries w/o filament | Sutter Instrument Company | B 150-86-10 | Glass to be pulled into fluid-jet needles to stimulate hair cells |
Pipette polisher | Narishige | MF-830 microforge | To polish fluid-jet pipette tips to smooth jagged breaks |
Ceramic tile | Sutter Instrument Company | NC9569052 | For scoring and evening breaking fluid-jet needles |
Sections 4 & 5 | |||
Fine forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 | For pinning larvae |
Gel loading tips | Eppendorf | 5242956003 | For backfilling heart injection needles |
Stereomicroscope | Carl Zeiss Microscopy | Stemi 2000 with transmitted light illumination | For illuminating larvae during pinning and heart injection |
Glass capillary/needle holder | WPI | MPH315 | To hold fluid-jet needles |
Manual micromanipulator | Narishige | M-152 | For holding and positioning of needle holder to inject α-bungarotoxin |
Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | For holding manual micromanipulator for α-bungarotoxin injection |
Pressure injector | Eppendorf | Femtojet 4x | To deliver α-bungarotoxin |
Sections 6, 7 & 8 | |||
Confocal microscope | Bruker | Swept field/Opterra confocal microscope | Fixed, upright microscope with DIC optics and 488nm laser with appropriate filters |
Microscope software | Bruker | Prairieview 5.3 | To coordinate and control the microscope, lasers, stage, piezo-z, cameras and fluid jet |
10X air objective | Nikon | MRH00101 | Low magnification for positioning of larvae and fluid jet |
60X water objective | Nikon | MRF07620 | Water immerison objective with high NA (1.0) and adequate working distance (2.0 mm) |
Piezo-Z objective scanner with controller/driver | Physik Intruments instruments/Bruker | 01144210/UM-Z-PZ | High-speed z-stack acquisition with 0.025um accuracy |
EMCCD camera | QImaging | Rolera EM-C2 EMCCD camera | Camera with small pixel size that can acquire up to 100 frames per s |
Circular chamber adapter | Siskiyou | PC-A | For holding and rotating imaging chamber on microscope stage |
Motorized Z-deck stage | Prior Scientific | ZDN12MP | Microscope stage that can hold and move sample and micromanipulator with fluid-jet needle together |
Z-deck stage insert adaptor | NIH Machine shop | custom | To fit the circular chamber adaptor onto the z-deck stage |
Fluid-jet apparatus | ALA scientific instruments | HSPC-1 High-speed pressure Clamp with PV-PUMP | For controlling and delivering the fluid-jet stimulus |
Masterflex Peroxide-cured silicone tubing (1 ft) | Cole-Palmer | Masterflex L/S 13, 96400-13 | For connecting the fluid-jet needle holder to pressure pump |
Motorized micromanipulator | Sutter Instrument Company | MP-225 | For holding and positioning of needle holder for fluid jet |
Micromanipulator controller | Sutter Instrument Company | MPC-200 | For controlling fluid-jet needle manipulator |
Gel loading tips | Eppendorf | 5242956003 | For backfilling fluid-jet needles |
Glass capillary/needle holder | WPI | MPH315 | To hold fluid-jet needles |
PSI manometer | Sper Scientific | 840081 | For measuring pressure clamp output |
Section 9 | |||
BAPTA, Tetrapotassium Salt, cell impermeant | ThermoFischer Scientific | B1204 | To cleave tips links, uncouple MET channels and block all evoked GCaMP6s signals |
Isradipine | Sigma-Aldrich | I6658 | To block signals dependent on the L-type calcium channels (CaV1.3) at the presynapse |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Solvent for pharmacological compounds |
Section 10 | |||
Prism7 | Graphpad | Prism7 | Software to plot GCaMP6 intensity changes |
FIJI | Schindelin, et., al.34 | https://fiji.sc/ | Software to process images and create spatio-temporal signal maps |
Turboreg Plugin | Thévenaz et., al.29 | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI |
StackReg Plugin | Thévenaz et., al.29 | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ | Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI |
Times Series Analyzer V3 Plugin | Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html | Plugin to create multiple ROIs to measure GCaMP6 intensity changes |