Выделение и характеристика человека пуповины производные мезенхимальных стволовых клеток из доношенных и недоношенных новорожденных
Summary
Пуповина человека (UC) могут быть получены в течение перинатального периода в результате преждевременных, термин и postterm доставки. В этом протоколе мы описываем изоляции и характеристика UC-производные мезенхимальных стволовых клеток (UC-МСК) из плодов/младенцев на 19-40 недель гестации.
Abstract
Мезенхимальных стволовых клеток (МСК) имеют значительный терапевтический потенциал и привлечь все больший интерес в области биомедицины. MSCs первоначально изолирован и характеризуется из костного мозга (БМ), то приобрел от тканей, включая жировой ткани, синовиальной оболочки, кожи, пульпы зуба и плода придатки как плаценты, пуповины кровь (УКБ) и пуповины (UC). MSCs являются популяции гетерогенных клеток с емкостью для (1) соблюдения пластик в условиях стандартной культуры, (2) поверхность маркер выражения CD73+/CD90+/CD105+/CD45 /CD34––/CD14–/CD19 –/HLA-DR– фенотипов и (3) trilineage дифференцировку в адипоциты, остеоциты и хрящевые клетки, как в настоящее время определяется международным обществом клеточной терапии (ИКСТ). Хотя BM является наиболее широко используемым источником MSCs, захватнический характер стремления BM этически ограничивает его доступность. Пролиферации и дифференцировки потенциала MSCs полученные от БМ в целом снижение с возрастом донора. В отличие от плода MSCs, полученные из UC имеют преимущества как энергичный распространения и дифференциации потенциал. Существует без этических озабоченность для UC выборки, как она обычно рассматривается как медицинские отходы. Человека UC начинает развиваться с продолжающийся рост амниотической полости в 4-8 недель гестации и продолжает расти до достижения 50-60 см в длину, и это может быть изолированы в период всей новорожденных доставки. Чтобы разобраться в патофизиологии сложных заболеваний, мы использовали UC-производные MSCs (UC-MSCs) от младенцев, роды на различных сроках гестации. В этом протоколе мы описываем, изоляции и характеристика UC-MSCs из плодов/младенцев в 19-40 недель гестации.
Introduction
Мезенхимальных стволовых клеток (МСК) первоначально изолированы и характеризуется из костного мозга (БМ)1,2 , но также можно получить из различных тканей, включая жировой ткани, синовиальной оболочки, кожи, пульпы зуба и плода придатков 3. MSCs признаны популяции гетерогенных клеток, которые могут размножаться и дифференцироваться в адипоциты, остеоциты и хондроцитов. Кроме того, MSCs обладают способностью перейти на сайты травмы, подавлять и модуляции иммунного ответа, переделывать и ремонт повреждений. В настоящее время MSCs из разных источников привлекали растущий интерес как источник для клеточной терапии против целого ряда сложных заболеваний, включая трансплантат – versus – хост болезнь, инфаркт миокарда и ишемии миокарда4,5 .
Хотя BM является наиболее хорошо изученных источником MSCs, инвазивность BM аспирации этически ограничивает его доступность. Пролиферации и дифференцировки потенциала MSCs полученные от БМ в целом снижение с возрастом донора. В отличие от плода MSCs полученные от плода придатки как плаценты, пуповины кровь (УКБ), и пуповины (UC) имеют преимущества, включая менее этические соображения относительно отбора проб и надежное распространение и дифференциации потенциал6 , 7. среди плода придатки, которые обычно удаляются как медицинские отходы, UCB и UC считаются плода орган, в то время как плацента считается fetomaternal. Кроме того плаценты и UCB необходимо пробы и собранных в точный момент новорожденных доставки, тогда как плаценты и UC могут быть собраны и обработаны после родов новорожденных. Соответственно UC является многообещающим источником MSC для клетки терапии8,9.
Человека UC начинает развиваться с прогрессивной расширения амниотической полости в 4-8 недель гестации, продолжает расти до 50-60 см в длину и могут быть изолированы в течение всего периода новорожденного доставки10. Чтобы разобраться в патофизиологии сложных заболеваний, мы используем UC-производные MSCs (UC-MSCs) от младенцев, роды в различных сроках гестации11,12. В этом протоколе мы опишем, как изолировать и характеризуют UC-MSCs из плодов/младенцев в 19-40 недель гестации.
Protocol
Representative Results
Discussion
MSCs могут быть изолированы от различных тканей и являются гетерогенной популяция клеток, которые не все Экспресс же фенотипические маркеры. Здесь мы изложили протокол, который проведет сбор и рассечение UC от преждевременных и срочных младенцев и позволяет изоляции и культуры UC-MSCs. Посл?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана дотаций для Scientific Research (C) (номер гранта: 25461644) и молодых ученых (B) (предоставление номера: 15 K 19614, 26860845, 17 K 16298) из JSP-страницы KAKENHI.
Materials
| 50mL plastic tube | AS One Coporation, Osaka, Japan | Violamo 1-3500-22 | |
| 12-well plate | AGC Techno Glass, Tokyo, Japan | Iwaki 3815-012 | |
| 60mm dish | AGC Techno Glass, Tokyo, Japan | Iwaki 3010-060 | |
| Cell strainer (100 μm) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Falcon 35-2360 | |
| Cell strainer (70 μm) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Falcon 35-2350 | |
| Alpha MEM | Wako Pure Chemical, Osaka, Japan | 135-15175 | |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | 172012 | |
| Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific, waltham, MA | OPTI-MEM Gibco 31985-070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Gibco 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA | Wako Pure Chemical, Osaka, Japan | 209-16941 | |
| PBS | Takara BIO, Shiga,Japan | T900 | |
| Purified enzyme blends | Roche, Mannheim, Germany | Liberase DH Research Grade 05401054001 | |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD14 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 347497 | Lot: 3220644, RRID: AB_400312 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD19 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 340364 | Lot: 3198741, RRID: AB_400018 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD34 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555822 | Lot: 3079912, RRID: AB_396151 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD45 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555483 | Lot: 2300520, RRID: AB_395875 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD73 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 550257 | Lot: 3057778, RRID: AB_393561 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD90 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555596 | Lot: 3128616, RRID: AB_395970 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD105 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 560839 | Lot: 4339624, RRID: AB_2033932 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 347367 | Lot: 3219843, RRID: AB_400293 |
| PE-conjugated mouse IgG1 k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555749 | Lot: 3046675, RRID: AB_396091 |
| PE-conjugated mouse IgG2a k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555574 | Lot: 3035934, RRID: AB_395953 |
| PE-conjugated mouse IgG2b k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555743 | Lot: 3098896, RRID: AB_396086 |
| Viability dye | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | Fixable Viability Stain 450 562247 | |
| Blocking reagent | Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan | Block Ace UKB80 | |
| FCM | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | BD FACSAria III Cell Sorter | |
| FCM software | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | BD FACSDiva | |
| Adipogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01 | |
| Osteogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01 | |
| Chondrogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01 | |
| Formaldehyde | Polyscience, Warrigton, PA | 16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814 | |
| Oil Red O | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | O0625 | |
| Arizarin Red S | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | A5533 | |
| Toluidine Blue | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | 198161 | |
| Microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-X700 |
References
- Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).
- Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 9 (5), 641-650 (1991).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal Stem Cells: Revisiting History, Concepts, and Assays. Cell Stem Cell. 2 (4), 313-319 (2008).
- Bianco, P. 34;Mesenchymal" stem cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 677-704 (2014).
- Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).
- Manochantr, S., et al. Immunosuppressive properties of mesenchymal stromal cells derived from amnion, placenta, Wharton’s jelly and umbilical cord. Internal Medicine Journal. 43 (4), 430-439 (2013).
- Arutyunyan, I., et al. Umbilical Cord as Prospective Source for Mesenchymal Stem Cell-Based Therapy. Stem Cells International. 6901286, (2016).
- Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. Concise Review: Wharton’s Jelly: The Rich, but Enigmatic, Source of Mesenchymal Stromal Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (7), 1620-1630 (2017).
- Zhu, D., Wallace, E. M., Lim, R. Cell-based therapies for the preterm infant. Cytotherapy. 16 (12), 1614-1628 (2014).
- Iwatani, S., et al. Gestational Age-Dependent Increase of Survival Motor Neuron Protein in Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells. Frontiers in Pediatrics. 5, 194 (2017).
- Iwatani, S., et al. Involvement of WNT Signaling in the Regulation of Gestational Age-Dependent Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cell Proliferation. Stem Cells International. , 8749751 (2017).
- Mennan, C., et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord. BioMed Research International. 916136, (2013).
- Capelli, C., et al. Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate. Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).
- Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
- Tong, C. K., et al. Generation of mesenchymal stem cell from human umbilical cord tissue using a combination enzymatic and mechanical disassociation method. Cell Biology International. 35 (3), 221-226 (2011).
- Han, Y. F., et al. Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods. Cytotechnology. 65 (5), 819-827 (2013).
- Paladino, F. V., Peixoto-Cruz, J. S., Santacruz-Perez, C., Goldberg, A. C. Comparison between isolation protocols highlights intrinsic variability of human umbilical cord mesenchymal cells. Cell Tissue Bank. 17 (1), 123-136 (2016).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Mareschi, K., et al. Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow. Journal of Cellular Biochemistry. 97 (4), 744-754 (2006).
- Choumerianou, D. M., et al. Comparative study of stemness characteristics of mesenchymal cells from bone marrow of children and adults. Cytotherapy. 12 (7), 881-887 (2010).
- Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells and Development. 22 (17), 2425-2439 (2013).
