Yalıtım ve insan göbek kordonu kaynaklı mezenkimal kök hücre erken Doğum ve terim bebekler karakterizasyonu
Summary
İnsan göbek kordonu (UC) sonucu olarak preterm, terim perinatal dönemde elde edilebilir ve teslimat postterm. Bu protokol için biz yalıtım ve UC kaynaklı mezenkimal kök hücre (UC-MSCs) karakterizasyonu fetusa/bebeklerde 19-40 hafta gebelik açıklar.
Abstract
Mezenkimal kök hücre (MSCs) önemli bir tedavi potansiyel var ve Biyomedikal alanında artan ilgi çekmek. MSCs aslında izole ve kemik iliği (BM) ile karakterize, sonra yağ dokusu, synovium, cilt, diş hamuru ve gibi plasenta, fetal ekleri dahil olmak üzere dokularda elde göbek kordon kanı (UCB) ve (UC) göbek kordonu. MSCs türdeş olmayan hücre nüfus (1) plastik Standart kültür koşulları, (2) yüzey marker ifade CD73 bağlılığı kapasiteli olan+/CD90+/CD105+/CD45–/CD34–/CD14–/CD19 –/HLA-DR– fenotipleri ve adipositler, osteocytes ve olarak şu anda hücresel terapisi (ISCT) için uluslararası toplum tarafından tanımlanan kondrosit, (3) trilineage farklılaşma. BM MSCs en çok kullanılan kaynak olsa da, BM aspirasyon invaziv doğası onun erişilebilirlik etik sınırlar. MSCs yayılması ve ayırt etme kapasitesini elde BM Genel olarak donör yaş ile düşüş. Buna ek olarak, fetal MSCs UC elde edilen güçlü yayılması ve ayırt etme kapasitesi gibi avantajlara sahip. Bu genellikle tıbbi atık olarak kabul edilir gibi UC örnekleme için etik endişe vardır. İnsan UC amniyon boşluğu büyüme gebelik 4-8 hafta devam ile geliştirmeye başlar ve 50-60 cm uzunluğunda erişene dek büyüyen tutar ve tüm yeni doğan teslim süresi sırasında ayrılmış olabilir. Dirençli hastalıklar Patofizyoloji bir anlayış kazanmak için UC kaynaklı MSCs (UC-MSCs) üzerinden çeşitli gestasyonel yaş teslim bebekler kullandık. Bu protokol için yalıtım ve karakterizasyonu UC-MSCs fetusa/bebeklerde üzerinden 19-40 hafta gebelik açıklanmaktadır.
Introduction
Mezenkimal kök hücre (MSCs) ilk olarak izole edilmiştir ve kemik iliği (BM)1,2 karakterize ama ayrıca çok çeşitli dokuların yağ dokusu, synovium, cilt, diş hamuru ve fetal ekleri dahil olmak üzere elde edilebilir 3. MSCs çoğalırlar ve adipositler, osteocytes ve kondrosit ayırmak bir türdeş olmayan hücre nüfus olarak tanınıyor. Buna ek olarak, MSCs yaralanma sitelere geçiş, bastırmak ve bağışıklık yanıtı, modüle yeteneğine sahip ve tadilat ve onarım yaralanma. Şu anda, farklı kaynaklardan gelen MSCs karşı dirençli hastalıklar, Greft – versus – host hastalığı, kalp krizi ve beyin enfarktüsü4,5 de dahil olmak üzere bir dizi hücre tedavisi için bir kaynak olarak ilgi çekti var .
BM MSCs en iyi karakterize kaynağı olsa da, BM aspirasyon invasiveness erişilebilirlik etik sınırlar. MSCs yayılması ve ayırt etme kapasitesini elde BM Genel olarak donör yaş ile düşüş. Buna ek olarak, fetal MSCs gibi plasenta, göbek kordon kanı (UCB), fetal ekleri elde edilen ve göbek kordonu (UC) örnekleme ve sağlam yayılması ve ayırt etme kapasitesi6 ile ilgili daha az Etik kaygılar da dahil olmak üzere avantajları var , 7. ise plasenta fetomaternal kabul genellikle tıbbi atık olarak atılır fetal ekleri arasında UCB ve UC fetal bir organ olarak kabul edilir. Buna ek olarak, plasenta ve UCB örneklenmiş olup ise plasenta ve UC toplanan ve yenidoğan doğumdan sonra işlenen yeni doğan teslimat, tam şu anda toplanan gerek. Buna göre UC hücre terapisi8,9için umut verici bir MSC kaynağıdır.
İnsan UC amniyon boşluğu progresif genişlemesi 4-8 hafta gebelik ile geliştirmeye başlar, 50-60 cm uzunluğunda kadar büyümeye devam ediyor ve yeni doğan teslim10bütün döneminde ayrılmış olabilir. Dirençli hastalıklar Patofizyoloji bir anlayış kazanmak için UC kaynaklı MSCs (UC-MSCs) üzerinden çeşitli gestasyonel yaş11,12, teslim bebekler kullanın. Bu protokol için yalıtmak ve UC-MSCs fetusa/bebeklerde 19-40 hafta gebelik karakterize nasıl açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
MSCs dokular çeşitli ayrılmış olabilir ve tüm express aynı fenotipik işaretleri yapmak hücre türdeş olmayan nüfus vardır. Burada, biz, erken Doğum ve terimi bebeklerin kılavuzları koleksiyonu ve UC diseksiyon ve yalıtım ve UC-MSCs kültürünü sağlayan bir protokol sıraladı. Bu iletişim kuralı başarıyla gelen fetusa/bebeklerde 19-40 gebelik haftasından itibaren teslim ve zorlu hastalık patofizyolojisi bazı yönlerini temsil ettikleri gösterdi ISCT ölçüt19 yerine ge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu iş için Scientific Research (C) Grants-in-Aid tarafından desteklenmiştir (sayı vermek: 25461644) ve genç bilim adamları (B) (sayılar vermek: 15 K 19614, 26860845, 17 K 16298) JSP’ler KAKENHI in.
Materials
| 50mL plastic tube | AS One Coporation, Osaka, Japan | Violamo 1-3500-22 | |
| 12-well plate | AGC Techno Glass, Tokyo, Japan | Iwaki 3815-012 | |
| 60mm dish | AGC Techno Glass, Tokyo, Japan | Iwaki 3010-060 | |
| Cell strainer (100 μm) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Falcon 35-2360 | |
| Cell strainer (70 μm) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Falcon 35-2350 | |
| Alpha MEM | Wako Pure Chemical, Osaka, Japan | 135-15175 | |
| Fetal bovine serum | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | 172012 | |
| Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific, waltham, MA | OPTI-MEM Gibco 31985-070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Gibco 15240-062 | |
| Trypsin-EDTA | Wako Pure Chemical, Osaka, Japan | 209-16941 | |
| PBS | Takara BIO, Shiga,Japan | T900 | |
| Purified enzyme blends | Roche, Mannheim, Germany | Liberase DH Research Grade 05401054001 | |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD14 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 347497 | Lot: 3220644, RRID: AB_400312 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD19 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 340364 | Lot: 3198741, RRID: AB_400018 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD34 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555822 | Lot: 3079912, RRID: AB_396151 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD45 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555483 | Lot: 2300520, RRID: AB_395875 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD73 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 550257 | Lot: 3057778, RRID: AB_393561 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD90 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555596 | Lot: 3128616, RRID: AB_395970 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against CD105 | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 560839 | Lot: 4339624, RRID: AB_2033932 |
| PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 347367 | Lot: 3219843, RRID: AB_400293 |
| PE-conjugated mouse IgG1 k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555749 | Lot: 3046675, RRID: AB_396091 |
| PE-conjugated mouse IgG2a k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555574 | Lot: 3035934, RRID: AB_395953 |
| PE-conjugated mouse IgG2b k isotype | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | 555743 | Lot: 3098896, RRID: AB_396086 |
| Viability dye | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | Fixable Viability Stain 450 562247 | |
| Blocking reagent | Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan | Block Ace UKB80 | |
| FCM | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | BD FACSAria III Cell Sorter | |
| FCM software | BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ | BD FACSDiva | |
| Adipogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01 | |
| Osteogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01 | |
| Chondrogenic differentiation medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01 | |
| Formaldehyde | Polyscience, Warrigton, PA | 16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814 | |
| Oil Red O | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | O0625 | |
| Arizarin Red S | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | A5533 | |
| Toluidine Blue | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | 198161 | |
| Microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-X700 |
References
- Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).
- Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 9 (5), 641-650 (1991).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal Stem Cells: Revisiting History, Concepts, and Assays. Cell Stem Cell. 2 (4), 313-319 (2008).
- Bianco, P. 34;Mesenchymal" stem cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 677-704 (2014).
- Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).
- Manochantr, S., et al. Immunosuppressive properties of mesenchymal stromal cells derived from amnion, placenta, Wharton’s jelly and umbilical cord. Internal Medicine Journal. 43 (4), 430-439 (2013).
- Arutyunyan, I., et al. Umbilical Cord as Prospective Source for Mesenchymal Stem Cell-Based Therapy. Stem Cells International. 6901286, (2016).
- Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. Concise Review: Wharton’s Jelly: The Rich, but Enigmatic, Source of Mesenchymal Stromal Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (7), 1620-1630 (2017).
- Zhu, D., Wallace, E. M., Lim, R. Cell-based therapies for the preterm infant. Cytotherapy. 16 (12), 1614-1628 (2014).
- Iwatani, S., et al. Gestational Age-Dependent Increase of Survival Motor Neuron Protein in Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells. Frontiers in Pediatrics. 5, 194 (2017).
- Iwatani, S., et al. Involvement of WNT Signaling in the Regulation of Gestational Age-Dependent Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cell Proliferation. Stem Cells International. , 8749751 (2017).
- Mennan, C., et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord. BioMed Research International. 916136, (2013).
- Capelli, C., et al. Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate. Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).
- Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
- Tong, C. K., et al. Generation of mesenchymal stem cell from human umbilical cord tissue using a combination enzymatic and mechanical disassociation method. Cell Biology International. 35 (3), 221-226 (2011).
- Han, Y. F., et al. Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods. Cytotechnology. 65 (5), 819-827 (2013).
- Paladino, F. V., Peixoto-Cruz, J. S., Santacruz-Perez, C., Goldberg, A. C. Comparison between isolation protocols highlights intrinsic variability of human umbilical cord mesenchymal cells. Cell Tissue Bank. 17 (1), 123-136 (2016).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Mareschi, K., et al. Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow. Journal of Cellular Biochemistry. 97 (4), 744-754 (2006).
- Choumerianou, D. M., et al. Comparative study of stemness characteristics of mesenchymal cells from bone marrow of children and adults. Cytotherapy. 12 (7), 881-887 (2010).
- Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells and Development. 22 (17), 2425-2439 (2013).
