Implantatie van hiPSC afkomstige hartspier Patches na myocardiale letsel in een cavia-Model
Summary
Hier presenteren we een protocol voor de inductie van links ventriculaire cryoinjury gevolgd door de inplanting van een patch van de hartspier, afgeleid van menselijke iPS-cel cardiomyocytes in een cavia-model.
Abstract
Als gevolg van de beperkte regeneratiecapaciteit van het hart in volwassen zoogdieren, myocardinfarct leidt tot een onomkeerbaar verlies van cardiomyocytes. Dit verlies van relevante hoeveelheden hartspier massa kan leiden tot het hartfalen. Naast hart transplantatie is er geen curatieve behandelingsoptie voor de eind-fase hartfalen. In tijden van organ donor tekort, zijn orgel onafhankelijke behandelmodaliteiten nodig. Links-ventriculaire assist apparaten zijn echter een veelbelovende therapie optie, vooral als bestemming therapie, beperkt door de bijwerkingen zoals beroerte, infecties en bloedingen. In de afgelopen jaren zijn verschillende cardiale reparatie strategieën met inbegrip van de injectie van stamcel, cardiale progenitoren of myocardiale weefselengineering onderzocht. Recente verbeteringen in de celbiologie toestaan voor de differentiatie van grote hoeveelheden van cardiomyocytes afgeleid van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC). Een van de strategieën van de cardiale reparatie momenteel onder evaluatie wordt kunstmatige hartweefsel transplantatie. Gemanipuleerde hartweefsel (EHT) is een driedimensionale in vitro gemaakte cardiomyocyte netwerk, met functionele eigenschappen van inheemse hartweefsel. We hebben EHT-patches gemaakt uit hiPSC afgeleid cardiomyocytes. Hier presenteren we een protocol voor de inductie van links ventriculaire myocardiale cryoinjury in een cavia, gevolgd door innesteling van hiPSC afgeleid EHT op de linker ventriculaire muur.
Introduction
Het aantal patiënten met hartfalen groeit in onze vergrijzende bevolking. Voor eind-fase hartfalen is orthotopic hart transplantatie de optie alleen curatieve behandeling. Met name in Europese landen is er echter een toenemende organ donor tekort. Alternatieve behandelingsopties zijn daarom noodzakelijk. Recente prestaties in mechanische bloedsomloop ondersteuning zijn veelbelovend, maar vooral op de lange termijn uitgevoerd, beperkt door de bijwerkingen zoals bloedingen, trombose van de pomp en infectieuze complicaties1.
De endogene regeneratiecapaciteit van de volwassen menselijke hart is zeer beperkt. Daarom zou kunnen cardiale regeneratie therapie worden een alternatieve behandelingsoptie voor einde-fase hartfalen patiënten2,3. Verschillende technieken met inbegrip van de injectie van stamcel gebaseerde cel of tissue engineering benaderingen geweest beschreven3,4,5.
Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC), evenals menselijke embryonale stamcellen (hESC) kunnen effectief worden gedifferentieerd naar spontaan verslaan menselijke cardiomyocytes6, dat is een mijlpaal op het gebied van regeneratieve cardiale therapieën.
Ter vervanging van myocard na een myocardinfarct en ter verbetering van de functie van een falende hart, is voortbestaan van een geschikt aantal cardiomyocytes en hun mechanische en elektrische koppeling met het eigen hart essentieel. Om te onderzoeken van het potentieel van cardiale regeneratieve therapie met menselijke iPS cel afgeleid cardiomyocytes, is een onderzoeksmodel geschikt nodig. Het ideale model moet kosteneffectief zijn en hebben een mens-achtig fysiologie en electrofysiologie. Grote diermodellen als varkens zou ideaal vanuit dat oogpunt, echter die experimenten zijn erg duur en grote hoeveelheden van cardiomyocytes zou nodig zijn ter vervanging van een relevant aantal cardiomyocytes om te zien van de effecten aan de linkerkant ventriculaire functie in een varken infarct model.
Elementaire biologische om vragen te beantwoorden naar menselijke cel-gebaseerde cardiale regeneratie, bijv zijn overleving van de cel, vascularisatie en elektrische koppeling, kleine dierlijke modellen meer geschikt. Uit de beschikbare kleine dierlijke modellen is de cavia de meest nuttige soort, ten opzichte van ratten en muizen, zoals hun electrofysiologie meer veel overeenkomsten vertoont met de situatie in mensen7. In dit model cavia geïnduceerde we een Transmurale cryoinjury van het linkerventrikel. Een week na inductie myocardiaal infarct innesteling van een drie-dimensionale, spontaan verslaan afgeleid van heupen-cel cardiomyocyte de patch werd uitgevoerd. De overleving van de cel van cardiomyocyte werd 28 dagen na implantatie geëvalueerd door histopathologisch onderzoek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Allerlei kleine dierlijke modellen zijn beschikbaar voor de studie van het effect dat cel transplantatie op gewonde harten9,10,11 oefent. We kozen voor een cavia model vanwege alle klein dier modellen zijn (electro) fysiologie lijkt meest nauw die van de mens. De voordelen van kleine dierlijke modellen zijn eenvoudige behuizing, beheersbare kosten en weinig arbeidskrachten. In vergelijking met muizen en ratten is Guinee pigs´ c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Voor deze studie werd geen financiering ontvangen
Materials
| Ventilator (VetFlo Dual Mode) | Kent Scientific | ||
| Forene | abbvie | 1000009819 | |
| Carprofen | Zoetis | 256692 | |
| Atropin | Braun | PZN 00648037 | |
| Buprenorphin | Sigma | ||
| Metal stamp | |||
| Electric soldering iron | Claytools | ||
| 3-0 prolene suture | Ethicon | ||
| 4-0 prolene suture | Ethicon | 662SLH | |
| 5-0 prolene suture | Ethicon | 8710H | |
| 8-0 prolene suture | Ethicon | 8841H | |
| Tungsten Carbide Scissor | FST | No. 14568-12 | |
| Stainless sterilization Container | FST | No. 20890-51 | |
| Graefe Forceps | FST | No.11652-10 | |
| Extra fine Graefe Forceps | FST | No.11150-10 | |
| Forceps | FST | No. 11022-15 | |
| Halsted- Mosquito | FST | No. 13009-12 | |
| Forceps | FST | No.13003-10 | |
| Baby Mixter | FST | No. 13013-14 | |
| Needle holder (Castroviejo with Tungsten Casbide Jaws) | FST | No. 12565-14 | |
| Needle Holder (Halsey) | FST | No. 12501-13 | |
| Alm Retractor with Blumt Teeth | FST | No. 17008-07 | |
| Spring Scissor | FST | No. 15000-00 | |
| Compress 5×5 | Fink + Walter | PZN 08821417 | |
| Venflon Pro Safety | Becton Dickinson | PZN11123964 | |
| Cautery High Temp 2" | Bovie Medical Corporation | 0100607151011055 |
References
- Kirklin, J. K., et al. Seventh INTERMACS annual report: 15,000 patients and counting. The Journal of heart and lung transplantation: the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 34, 1495-1504 (2015).
- Soonpaa, M. H., Field, L. J. Survey of studies examining mammalian cardiomyocyte DNA synthesis. Circulation research. 83, 15-26 (1998).
- Shiba, Y., Hauch, K. D., Laflamme, M. A. Cardiac applications for human pluripotent stem cells. Current pharmaceutical design. 15, 2791-2806 (2009).
- Shiba, Y., et al. Human ES-cell-derived cardiomyocytes electrically couple and suppress arrhythmias in injured hearts. Nature. 489, 322-325 (2012).
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
- Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell stem cell. 8, 228-240 (2011).
- Watanabe, T., Rautaharju, P. M., McDonald, T. F. Ventricular action potentials, ventricular extracellular potentials, and the ECG of guinea pig. Circulation research. 57, 362-373 (1985).
- Weinberger, F., et al. Cardiac repair in guinea pigs with human engineered heart tissue from induced pluripotent stem cells. Science translational medicine. 8, 363ra148 (2016).
- Shiba, Y., et al. Electrical Integration of Human Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in a Guinea Pig Chronic Infarct Model. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapy. 19, 368-381 (2014).
- van Laake, L. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes survive and mature in the mouse heart and transiently improve function after myocardial infarction. Stem cell research. 1, 9-24 (2007).
- Zimmermann, W. H., et al. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nature medicine. 12, 452-458 (2006).
- Johns, T. N., Olson, B. J. Experimental myocardial infarction. I. A method of coronary occlusion in small animals. Annals of surgery. 140, 675-682 (1954).
- van den Bos, E. J., Mees, B. M., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: a comparison with coronary artery ligation. Heart and circulatory physiology. , H1291-H1300 (2005).
