En exosome er en ny generation af drug delivery luftfartsselskaber. Vi etablerede en exosome isolation protokol med højt udbytte og renhed for siRNA levering. Vi har også indkapslet fluorescently mærket uspecifikke siRNA i exosomes og undersøgt den cellulære optagelse af siRNA-loaded exosomes i kræftceller.
Ekstracellulære vesikler, i særlige exosomes, har for nylig fået interesse som roman stof levering vektorer på grund af deres biologiske oprindelse, overflod og iboende evne i intercellulære levering af forskellige biomolekyler. Dette arbejde etablerer en isolation protokol for at opnå høj ydelse og høj renhed af exosomes for siRNA levering. Menneskelige embryonale nyreceller (HEK-293 celler) er kulturperler i bioreaktor kolber og kultur supernatanten (hereon omtalt som konditioneret medium) er høstet på ugentlig basis at tillade berigelse af HEK-293 exosomes. Konditioneret medium (CM) er pre ryddet af døde celler og celleaffald ved differentieret centrifugering og underkastes ultracentrifugering på en saccharose pude efterfulgt af en vask skridt, til at indsamle exosomes. Isolerede HEK-293 exosomes er karakteriseret for udbytte, morfologi og exosomal markør udtryk ved nanopartikel tracking analyse, protein kvantificering, Elektron Mikroskopi og flowcytometri, henholdsvis. Lille interfererende RNA (siRNA), fluorescently mærket med Atto655, er indlæst i exosomes af elektroporation og overskydende siRNA er fjernet af gel filtrering. Celle optagelse i PANC-1 kræftceller, efter 24 timers inkubation ved 37 ° C, er bekræftet ved flowcytometri. HEK-293 exosomes er 107.0 ± 8.2 nm i diameter. Exosome udbytte og partikel til protein forholdet (P:P) forholdet er 6.99 ± 0,22 × 1012 partikel/mL og 8.3 ± 1,7 × 1010 partikel/µg, henholdsvis. SiRNA i exosomes indkapsling effektivitet er ~ 10-20%. Fyrre procent af cellerne vise positive signaler for Atto655 på 24 h efter inkubation. Afslutningsvis tilbyder exosome isolation af ultracentrifugering på saccharose pude en kombination af gode afkast og renhed. siRNA kunne være korrekt indlæst i exosomes af elektroporation og efterfølgende leveres i kræftceller in vitro-. Denne protokol tilbyder en standard procedure for at udvikle siRNA-loaded exosomes til effektiv levering til kræftceller.
Exosomes er en undertype af ekstracellulære vesikler (EV) spænder fra 50-200 nm i diameter, udskilles af forskellige celletyper såsom immunceller1,2, kræftceller3,4,5, 6 og stilk celler7. Exosomes har også vist sig at være til stede i forskellige fysiologiske væsker8,9,10,11. Kombinationen af exosomes iboende evne til at bære forskellige biomolekyler (fx, RNA og proteiner)12,13,14 og effektiv levering af disse biomolekyler i modtagerens celler 15 , 16 , 17 tiltrukket interesse for deres potentiale som nano-skala drug delivery vektorer. Forskellige små molekyler, der tjener som anti-cancer og anti-inflammatoriske lægemidler har vist sig for at være korrekt indlæst i exosomes og leveret til target celler18,19,20, 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. det er interessant, nukleinsyrer som siRNA28,29 og mikroRNA30 også er succesfuldt indlæst i exosomes via elektroporation og leveret til target-cellerne.
For nylig, RNA interferens (RNAi) via små interfererende RNA (siRNA) har fået større interesse som den foretrukne mekanisme i genhæmning på grund af sin høje specificitet, potent virkning, minimale bivirkninger og lethed af siRNA syntese28, 29. siRNAs er dobbelt-strenget RNA molekyler spænder fra 19 til 25 nukleotider i længde at udløsere sekvens-specifikke katalytisk mRNA knockdown. På grund af dens store molekylvægt og polyanionic karakter er passiv optagelsen af nøgne siRNA ind i cellerne hindret28,29. Det er heller ikke muligt for nøgen siRNA til at blive injiceret i systemisk cirkulation på grund af hurtig nedbrydning af plasma nukleaser31. Således ville indkapsling af siRNA i en nanocarrier støtte effektiv levering og optagelsen af siRNA i target-cellerne.
Exosomes er et ideelt system til siRNA indkapsling som sin struktur er sammensat af en hule, vandig core omsluttet af en phospholipid tolagede. Exosomes ikke blot har god stabilitet i blodet men også har naturlige målretning egenskaber at levere funktionelle RNA i celler32. Undersøgelse foretaget af Alvarez-Erviti et al. med succes demonstreret effektiv levering af siRNA til hjernen hos mus bruger manipuleret exosomes med næsten ingen komplikationer31. Det er en hypotese, exosome-baseret terapi er forholdsvis mere sikkert end andre behandlingsformer som exosomes ikke replikere endogent, da cellerne ønsker og derfor ikke udviser metastatisk egenskaber15.
Forskellige metoder er blevet rapporteret med held isolere exosomes fra enten cellekultur eller fysiologiske væsker. Den mest populære metode bruger ultracentrifugering for at sammenpresse exosomes fra start materiale31,32,33. Denne metode kan være ganske hårde på exosomes og normalt Co bundfald proteiner fra prøven. Kombinere ultracentrifugering med en massefylde-baseret adskillelse som saccharose forløb bliver mere almindeligt, at reducere protein og ikke-exosomal kontaminering i isolerede exosomes19,34. Størrelse-udelukkelse kromatografi (SEC) giver mulighed for adskillelse af exosomes fra andre typer af ekstracellulære vesikler (EV) ved størrelse og kan også resultere i minimal protein forurening men er begrænset af lille mængde starter materiale det kan behandle35, 36. Immunoaffinity opsamling bruger perler belagt med antistoffer, der bindes til exosomal overflade proteiner som tetraspanins eller andre celle-specifikke markør, der giver mulighed for specifikke erobringen af exosomes i stedet for evt- eller andre proteiner, samt isolere delpopulation af exosomes fra hele prøver, men igen er begrænset af mængden af start materiale og er dyre36,37. Polymer-baserede udfældning af exosomes plejede at være populære også, men da det er en temmelig rå nedbør, det fører til en højere ikke-exosomal vesikel og protein forurening38,39.
Elektroporation er blevet rapporteret til dens ineffektivitet som en metode til at indlæse exosomes med siRNA på grund af protein sammenlægning15,28,31. Transfektion-baserede tilgange blev påvist for at have bedre lastning effektivitet og protein stabilitet, men er uønskede på grund af dens toksicitet og bivirkninger af Transfektion agenter at ændre cellulære gen expression28. Således har elektroporation været mere udbredt i siRNA ilægning i exosomes, da det er en sikrere metode. Men en optimeret encapsulation metode skal indføres for at levere tilstrækkelige mængder af siRNA til mål-webstedet til en potent gen knockdown.
Her foreslår vi en exosome isolation protokol bruger tæthed-baserede ultracentrifugering på bare en enkelt 25% (w/w) saccharose pude forberedt i deuteriumoxid, snarere end et saccharose tæthed farveforløb. Dette er en omkostningseffektiv metode, der omgår den møjsommelige tæthed gradient forberedelse og tillader behandling af store mængder af starter materiale, men resulterer i intakt exosomes af højt udbytte og renhed egnet til efterfølgende indlæsning med siRNA. Fluorescerende Atto655-konjugeret uspecifikke siRNA blev indlæst i menneskelige embryonale nyre celler (HEK-293 celler) afledt exosomes via elektroporation og leveret til menneskelige i bugspytkirtlen adenocarcinom (PANC-1) kræftceller in vitro-.
At opnå en anstændig exosome udbytte fra dyrkede celler, er som er nok til flere runder in vitro eller i vivo undersøgelser, stadig en udfordring. Ifølge producenten, var bioreaktor kolberne beregnet til produktion af antistoffer og proteiner med højt udbytte fra kultur af forskellige udødeliggjort cellelinjer. Dette tillader cellerne at løbende berige næringssubstratet med den ønskede vare, hvilket resulterer i en koncentreret konditioneret medium (CM) i celle-rum. Teoretisk set, det samme koncept ville være gavnlige i exosome produktion fra forskellige cellelinjer, og faktisk dyrkning af disse celler i bioreaktor kolber blev demonstreret for markant at øge exosome udbytte40. Den store mellemstore reservoir kontinuerligt leverer næringsstoffer til og fjerner affald fra celle rum via en 10 kDa semipermeabel membran, giver langvarig kultur uden at kræve en stor mængde af medium til at være i kontakt med cellerne, eller regelmæssig kolber ændring, som kan i sidste ende spare de samlede omkostninger og arbejdskraft af høj-skala exosome produktion40. Det blev også påvist, at morfologi, fænotype samt immunmodulerende funktioner af exosomes isoleret celler langsigtede bioreaktor kolber kulturer der ligner der stammer fra celler dyrkes i regelmæssig 75 cm2 kolber40. Kultur af andre udødeliggjort cellelinjer som exosome kilder i bioreaktor kolben vil derfor bidrage til at øge deres exosome udbytte samtidig bevare deres integritet og funktion. Denne form for kultur er imidlertid ikke relevant for primærelementer med begrænset division cyklusser, og dem, der ikke kan være kulturperler i høj densitet.
Da høsten af CM foregår ugentligt, og cellerne i kulturen blev aldrig passaged, kan det antages, at cellerne i bioreaktor kolben ikke vokser i en éncellelag som den regelmæssige cellekultur. De er mest tilbøjelige til at danne klynger med nekrotisk centre, eller blot løsne sig fra overfladen og dø når cellerne er også sammenflydende for en éncellelag. Besigtigelse af celle til kabinen bioreaktor kolbens er ikke muligt at bekræfte denne antagelse, men afspejles af det store antal døde celler fremstillet under CM høst. Regelmæssig fjernelse af dårligt tilhænger og ikke-levedygtige celler fra bioreaktor kolben kan forhindre ophobning af materialer på den semipermeable membran, der kan påvirke udvekslingen af gas, næringsstoffer og affald mellem celle rum og mediet reservoir, således at langvarig kultur i bioreaktor kolberne for > 6 måneder40. I denne forbindelse, denne ikke-formelle rigtighed cellevækst i bioreaktor kolberne er ideel som vi spekulere at den efterligner den faktiske tilstand af tumor vækst i vivo tættere end konventionelle éncellelag cellekultur, og det er håbet, at exosomes produceret af kræft celler i bioreaktor kolben ville være mere ligner der udskilles af tumorer in vivo. Dette vil være særligt gavnligt i undersøgelser, der ser ind i rollen som tumor-afledte exosomes i progressionen af tumor patologi. Tumor-afledte exosomes er blevet rapporteret til uløseligt og fortrinsvis hjem til deres væv af oprindelse32, derfor har exosomes produceret i et system, der efterligner deres i vivo produktion ville også være ønskeligt i undersøgelser, der ser på at udforske den passive målretning evne af exosomes som lægemiddel nanocarriers.
P:P forholdet blev rapporteret som en parameter til vurdering af renheden af isolerede exosomes fra forurener proteiner fra næringssubstratet af fysiologiske væsker som exosomes blev indkøbt fra41. P:P forholdet mellem 8.3 ± 1,7 × 1010 p/µg indhentet i denne undersøgelse falder inden for området høj renhed foreslås i undersøgelsen. Dette forhold understreger faren ved hjælp af proteinkoncentration udtrykke udbytte eller dosis af exosomes isoleret eller anvendes i undersøgelser, nedstrøms henholdsvis, som det ikke afspejler det sande antal exosomes tilgængelige i stikprøven givet problemet med protein forurening under dyrkning. NTA via instrumenter såsom NanoSight, som måler koncentrationen af exosomes i partikel antallet, er en mere fornuftig og præcis måde af kvantificere exosomes.
Meget præcis vejning under udarbejdelsen af 25% rørsukkeropløsning deuteriumoxid er afgørende, da denne metode er en massefylde-baserede isolering. Exosomes har en temmelig smal vifte af flotation tæthed i rørsukkeropløsning så præcis forberedelse af saccharose pude vil reducere forurening af ikke-exosomal vesikler såsom apoptotiske organer eller fremstillet på basis af Golgi vesikler under isolation42. Det tilrådes ikke at holde sidesten rørsukkeropløsning og bruger det selv efter en dag for at undgå risikoen for faktorer, der kan ændre dets massefylde f.eks tab eller tilsætning af vand i løsningen af enten fordampning eller kondensering af luften i røret. Brug af en swing-out rotoren er også væsentlige under centrifugering på saccharose pude til at tillade endda overflytning af exosomes fra CM til rørsukkeropløsning.
Fratagelse af saccharose løsning efter centrifugering er også en delikat skridt, og det drejer sig om at finde et kompromis mellem maksimere mængden af exosomes inddrives, og ikke for meget at protein fra dyrkningsmediet er introduceret til exosome prøven udtages . Grænsefladen mellem rørsukkeropløsning og mediet, betingelse er hvor proteiner fra næringssubstratet ville indsamle efter centrifugering, og kan normalt ses som en mørk brun ring, der sidder på grænsefladen. I vores hænder er hævning 2 mL af saccharose pude fra de oprindelige 3 mL tilsat den optimale volumen, der er enig med det kompromis, der er nævnt ovenfor. De mængder, der er beskrevet i denne protokol er for de specifikke rotorer anvendes; Derfor, det tilrådes at optimere mængden saccharose trækkes tilbage når skalering opad eller nedad diskenheder for typerne af rotorer findes i forskellige faciliteter. Det er også vigtigt at undgå lige på midten af bunden af røret, når trække saccharose, da dette er hvor partikler af højere tæthed end saccharose bliver sediment og kan normalt ses som en off-white pellet.
Trinnet vask med en forholdsvis stor mængde af PBS hjælper til yderligere for at reducere graden af protein forurening under exosome isolation41. Dette trin er også afgørende for at fjerne overskydende saccharose fra exosomes for at undgå osmotisk skader på exosomes selv eller biomolekyler i exosomal lumen, samt reducere risikoen for bakteriel og/eller svampe vækst på exosome lager. Forberede rørsukkeropløsning i deuteriumoxid snarere end vand hjælper med at reducere mængden af sakkarose for at opnå exosome flotation tæthed for isolation, dermed mindske risikoen for både osmotisk skader og mikrobiel kontaminering. Efter den første centrifugering på saccharose pude, exosome-holdige saccharose lag trukket tilbage og føjet til PBS kan opbevares ved 4 ° C og behandles den følgende dag hvis konfronteret med tidspresset.
Til bedste af vores viden er exosome/siRNA kindtand forholdet en vigtig faktor for effektiviteten af elektroporation. I denne protokol brugte vi 1:60 som exosome at siRNA molære forhold. Som indkapsling mulighed for forskellige typer af exosomes er forskellige, anbefaler vi kraftigt at optimeres på et sag til sag grundlag. Indkapsling effektivitet foreslået heri kan dog altid være en parameter for at vælge de optimale elektroporation betingelser.
Derudover menes sammenlægning af siRNA at være en af de mest almindelige problem i elektroporation. Det er bevist, at elektroporation kan fremkalde stærke sammenlægning af siRNA, hvilket gør det endnu sværere at komme ind exosomes. siRNA sammenlægninger er ofte fejlagtigt fortolkes som indkapsling af siRNA i exosome derfor ordentlig kontrol blev anvendt i denne undersøgelse som dannelsen af siRNA aggregater er uundgåelig i løbet af elektroporation28. Procentdel indkapsling effektiviteten af vores rensning metode blev beregnet ved hjælp af normaliserede værdier for at minimere påvirkning fra andre kilder såsom baggrund støj, exosome og siRNA sammenlægninger, som ville påvirke datapålidelighed. Baseret på vores resultater, var der ubetydelig siRNA sammenlægninger observeret i den kontrol prøve dvs. ved hjælp af electroporated og un-electroporated siRNA.
Denne protokol har vist siRNA indkapsling i exosomes og deres efterfølgende intracellulære levering af siRNA til kræft celler in vitro. Forskellige typer af exosomes fra forskellige cellelinjer kan derfor være isoleret og karakteriseret ved hjælp af den foreslåede protokol og efterfølgende fyldt med forskellige terapeutiske siRNA for forskellige typer af muterede mål over udtrykt i forskellige kræftformer. Et interessant program ville være at udforske siRNA levering og optagelse effektivitet ved hjælp af forskellige permutationer af exosome kilde-mål celle par in vitro. Dette kan derefter oversættes til dyremodeller for at vurdere effektiviteten af både levering og terapeutisk effektivitet af siRNA-indkapslede exosomes in vivo.
The authors have nothing to disclose.
F. N. Faruqu er finansieret af den malaysiske regering agentur Majlis Amanah Rakyat (MARA). L. Xu er modtager af Marie Curie-Sklodowska individuelle stipendier (Horizon 2020) (H2020-MSCA-IF-2016). K. T. Al-Jamal anerkender finansiering fra BBSRC (BB/J008656/1) og Wellcome Trust (WT103913). Forfatterne vil også gerne takke Dr. Paul Lavender og Dr. David Fear (Institut for respiratorisk medicin og allergi, King’s College London) for at give electroporator.
Material | |||
Sterile Newborn Calf Serum Heat Inactivated | First Link | 08-05-850 | 500 ml |
EMEM medium | Thermo Fisher Scientific | 11090081 | 500 ml |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | 100 ml |
GlutaMax | Thermo Fisher Scientific | 35050-038 | 100 ml |
Sucrose | Fisher Scientific | S/8600/60 | 1 kg |
Deuterium oxide (D2O) | Sigma-Aldrich | 151882 | 250 g |
1X Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010015 | 500 ml |
Glycine | VWR Chemicals | 101196X | 1 kg |
Sepharose CL-2B | GE Healthcare Life Sciences | 17-0140-01 | 1 L; Particle Size 60 μm-200 μm |
Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300096 | 100 ml |
Aldehyde/sulfate latex beads | Thermo Fisher Scientific | A37304 | 4% w/v, 4 µm, 15 ml |
MicroBCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23235 | |
CD81 antibody (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-0819-42 | Lot: E15950-104. RRID: AB_11150235. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD81 isotype (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-4714-81 | Lot: 4291563. RRID: AB_763650. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD9 antibody (FITC) | Thermo Fisher Scientific | 11-0098-41 | Lot: 4345870. RRID: AB_10698007. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD9 isotype (FITC) | Thermo Fisher Scientific | 11-4714-41 | Lot: 4299784. RRID: AB_10598647. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD63 antibody (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-0639-41 | Lot: 1930435. RRID: AB_2572564. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD63 isotype (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-4714-81 | Lot: 1937696. RRID: AB_470059. 1:10 dilution in 50 µl sample |
Atto655-siRNA | Eurogentec | SQ-SIRNA | (Labelled-S) UGC-GCU-ACG-AUC-GAC-GAU-G55; (Unlabelled-AS) CAU-CGU-CGA-UCG-UAG-CGC-A55. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Millipore | SLGP033RS | |
CELLine AD1000 bioreactor flasks | Wheaton | WCL1000ad | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-80 | |
Swing-out rotor | Beckman Coulter | SW45 Ti | |
Fixed-angle rotor | Beckman Coulter | Type 70 Ti | |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355631 | Polycarbonate. Max. fill 32 ml |
Ultracentrifuge bottles | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate. Min. fill 16 ml, max. fill 25 ml |
NanoSight | Malvern | LM10 | Software: NanoSight NTA v3.2 |
Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Plate reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
Flow cytometry tubes | BD Biosciences, Falcon | 352052 | |
Microfuge tubes | Starlab | S1615-5500 | 1.5 ml |
Cell culture flasks | Fisher Scientific | 156499 | 75 cm2 |
Transmission electron microscope | FEI Electron Optics | Philips CM 12 | with Tungsten filament and a Veleta – 2k × 2k side-mounted TEM CCD Camera (Olympus, Japan) |
Amaxa Nucleofector I | Lonza | Nucleofector I | with Amaxa’s Nucleofector Kits |
24-well flat-bottom plates | Corning | Costar | |
Blunt fill needle | BD Biosciences | 305180 | 18G x 1 1/2" (1.2 mm x 40 mm) |
Glass pipettes | Fisher Scientific | 1156-6963 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | Composition | ||
Normal medium | Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% foetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax. | ||
Exosome-depleted medium | Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% exosome-depleted FBS (see below), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax. | ||
Exosome-depleted FBS | Subject FBS to ultracentrifugation at 100,000 g for 18 h at 4°C. The FBS supernatant post-centrifugation was collected and sterile-filtered using 0.22 µm filters. | ||
25% w/w sucrose cushion | Add 1.9 g (± 0.001 g) of sucrose in a universal tube, and top up with D2O until the weight reaches 7.6 g (± 0.001 g). This makes ~6ml of the 25% w/w sucrose cushion. | ||
3% FBS/PBS | Add 1.5 ml exosome-depleted FBS to 48.5 ml 1X PBS to prepare 50 ml of 3% FBS/PBS. | ||
100 µM BSA solution | Prepare 1mM BSA solution by adding 0.3325 g to 50 ml PBS. Make 1:10 dilution of this stock to obtain 100 µM BSA solution. Make 5-10 µl aliqouts of this 100 µM BSA solution (for single use) and store them at -20°C. All BSA solution should be stored at -20°C, and discard solutions that have undergone ≥2 freeze-thaw cycles. | ||
100 mM glycine solution | Add 0.375 g of glycine to 50 ml PBS to obtain 100 mM glycine solution, store at 4°C. | ||
Citric acid buffer with EDTA | Mix 0.1954 g citric acid and 0.2087 g disodium phosphate in 50 mL of deionised water. Add EDTA to 0.1 mM. Adjust pH to 4.4. | ||
Fixing solution | Prepare formaldehyde/glutaraldehyde, 2.5% (w/v) each in 0.1 M sodium cacodylate buffer, and adjust pH to 7.4. | ||
Aqueous uranyl acetate | Prepare 25% (v/v) uranyl acetate in methanol. | ||
50% methanol/H2O | Mix methanol and H2O 1:1 (v/v). | ||
SEC Column packed with Sepharose CL-2B | Dilute 37.5 ml Sepharose CL-2B resin with 12.5 ml PBS to obtain 75% Sepharose CL-2B solution. Pour the Sepharose CL-2B solution into a column of dimension 2.9 cm [H] x 1.3 cm [W]. Pour the Sepharose CL-2B to 3-4 mm above the stated height, and then press it down to the stated height with the filter for optimal packing. |