En exosome är en ny generation av drogen leverans bärare. Vi etablerade en exosome isolering protokoll med hög avkastning och renhet för siRNA delivery. Vi också inkapslade fluorescently märkta ospecifika siRNA in exosomes och undersökt det cellernas upptaget av siRNA-loaded exosomes i cancerceller.
Extracellulära vesicles, i synnerhet exosomes, har nyligen vunnit intresse som romanen drog leverans vektorer på grund av deras biologiska ursprung, överflöd och inneboende kapacitet i intercellulära leverans av olika biomolekyler. Detta arbete fastställs ett isolering protokoll för att uppnå hög avkastning och hög renhet av exosomes för siRNA delivery. Mänskliga embryonala njurceller (HEK-293 celler) odlas i bioreaktor kolvar och kulturen supernatant (härefter benämnd luftkonditionerade medium) skördas på veckobasis för anrikning av HEK-293 exosomes. Konditionerat medium (CM) rensas före av döda celler och cellulära skräp genom differential centrifugering och utsätts för ultracentrifugering på en sackaros kudde följt av en tvätt steg, samla in exosomes. Isolerade HEK-293 exosomes kännetecknas för avkastning, morfologi och exosomal markör uttryck av nanopartiklar spårning analys, protein kvantifiering, elektronmikroskopi och flödescytometri, respektive. Liten störande RNA (siRNA), fluorescently märkt med Atto655, läses in i exosomes av elektroporation och överflödig siRNA avlägsnas genom gelfiltrering. Cell upptag i PANC-1 cancerceller, efter 24 h inkubation vid 37 ° C, bekräftas av flödescytometri. HEK-293 exosomes är 107,0 ± 8,2 nm i diameter. Exosome avkastning och partikel-till-protein baserat (hästar) förhållandet är 6.99 ± 0,22 × 1012 partikel/mL 8,3 ± 1,7 × 1010 partikel/µg, respektive. Inkapsling effektiviteten av siRNA i exosomes är ~ 10-20%. Fyrtio procent av cellerna visar positiva signaler för Atto655 på 24 h efter inkubation. Avslutningsvis erbjuder exosome isolering av ultracentrifugering på sackaros kudde en kombination av god avkastning och renhet. siRNA kunde läsas framgångsrikt in i exosomes av elektroporation och därefter levereras till cancerceller in vitro-. Detta protokoll erbjuder ett standardförfarande för att utveckla siRNA-laddat exosomes för effektiv leverans till cancerceller.
Exosomes är en undertyp av extracellulära blåsor (EV) sträcker sig från 50-200 nm i diameter, utsöndras av olika celltyper som immunceller1,2, cancerceller3,4,5, 6 och stamceller7. Exosomes har också visat sig vara närvarande i olika fysiologiska vätskor8,9,10,11. Kombinationen av exosomes inneboende förmåga att bära olika biomolekyler (t.ex., RNA och proteiner)12,13,14 och effektiv leverans av dessa biomolekyler i mottagarens celler 15 , 16 , 17 väckte intresse för deras potential som nano-skala drogen leverans vektorer. Olika små molekyler som tjäna som anti-cancer och antiinflammatoriska läkemedel har visat sig vara framgångsrikt in i exosomes och levererats till målet celler18,19,20, 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. intressant, nucleic syror såsom siRNA28,29 och mikroRNA30 har också varit framgångsrikt lastade in exosomes via elektroporation och levererats till målceller.
Nyligen, RNA interferens (RNAi) via små störande RNA (siRNA) har vunnit mer intresse som Rekommenderad mekanismen i nedtystning på grund av dess hög specificitet, potent effekt, minimala biverkningar och användarvänlighet siRNA syntes28, 29. siRNAs är dubbelsträngat RNA-molekyler som sträcker sig från 19 till 25 nukleotider i längd som utlösare sekvens-specifika katalytisk mRNA knockdown. På grund av dess stora molekylvikt och polyanjonisk natur är passiv upptag av nakna siRNA i celler hindras28,29. Det går inte heller för nakna siRNA att injiceras i den systemiska cirkulationen på grund av snabb nedbrytning av plasma nukleaser31. Således skulle inkapsling av siRNA i nanocarrier stöd effektiv leverans och upptag av siRNA i målceller.
Exosomes är ett idealiskt system för siRNA inkapsling eftersom dess struktur består av en ihålig, vattenhaltigt kärna höljebärande av en fosfolipid lipidens. Exosomes inte bara har bra stabilitet i blodet men också har naturliga inriktning egenskaper att leverera funktionella RNA in celler32. Den studie som genomfördes av Alvarez-Erviti et al. framgångsrikt visat effektiv leverans av siRNA till hjärnan hos möss med konstruerad exosomes med praktiskt taget inga komplikationer31. Det är en hypotes om att exosome-baserad terapi är relativt säkrare än andra terapier som exosomes inte replikeras endogenously som celler och därför inte uppvisar metastaserande boenden15.
Olika metoder har rapporterats att framgångsrikt isolera exosomes från antingen cellkultur eller fysiologiska vätskor. Den mest populära metoden används ultracentrifugering till pellet exosomes från start material31,32,33. Denna metod kan vara ganska hårda på exosomes och oftast samtidig fällningar proteiner från provet. Att kombinera ultracentrifugering med en densitet-baserade separation såsom sackaros lutningar blir allt vanligare, att minska protein och icke-exosomal förorening i den isolera exosomes19,34. Storlek-utslagning kromatografi (SEC) tillåter separation av exosomes från andra typer av extracellulära blåsor (EV) av storlek och kan också resultera i minimal protein kontaminering men begränsas av liten mängd utgångsmaterial som kan bearbeta35, 36. Immunoaffinity datafångsten pärlor belagd med antikroppar som binder till exosomal ytproteiner såsom tetraspanins eller andra cell-specifik markör som tillåter viss avskiljning av exosomes i stället för EVs eller andra proteiner, samt isolera subpopulation av exosomes från hela prover, men igen begränsas av mängden utgångsmaterial och är kostsamma36,37. Polymerbaserade utfällning av exosomes brukade vara populära också, men eftersom det är en ganska rå nederbörd, det leder till en högre icke-exosomal vesikler och protein kontaminering38,39.
Elektroporation har rapporterats för dess ineffektivitet som en metod att ladda exosomes med siRNA på grund av protein sammanläggning15,28,31. Transfection tillvägagångssätt var visat sig ha bättre lastning effektivitet och protein stabilitet, men är inte önskvärt på grund av dess toxicitet och biverkningar av transfection agenter att förändra cellulära gen uttryck28. Således har elektroporation använts mer allmänt i siRNA laddar in exosomes eftersom det är en säkrare metod. En optimerad inkapslingsmetod måste dock fastställas för att leverera tillräckliga mängder av siRNA till målplatsen för en potent gen knockdown.
Här föreslår vi en exosome isolering protokoll använder densitet-baserade ultracentrifugering på bara en enda 25% (w/w) sackaros kudde beredd i deuteriumoxid, snarare än en sackaros täthetlutning. Detta är en kostnadseffektiv metod som kringgår mödosamma täthet lutning beredning och tillåter bearbetning av stora volymer av utgångsmaterial, men resulterar i intakt exosomes av hög avkastning och renhet lämpar sig för efterföljande lastning med siRNA. Fluorescerande Atto655-konjugerad ospecifika siRNA lästes in i mänskliga embryonala njure celler (HEK-293 celler) exosomes via elektroporation och levereras till mänskliga pankreas adenocarcinom (PANC-1) cancerceller in vitro-.
Att få en anständig exosome avkastning från odlade celler, är som är nog för flera omgångar av in vitro eller in-vivo studier, fortfarande en utmaning. Enligt tillverkaren var bioreaktor kolvar avsedda för produktion av antikroppar och proteiner med hög avkastning från kultur av olika förevigade cellinjer. Detta gör att cellerna att kontinuerligt berika odlingssubstratet med önskad produkt, vilket resulterar i en koncentrerad luftkonditionerade medium (CM) i cell-facket. Teoretiskt sett samma koncept skulle vara fördelaktigt i exosome produktion från olika cellinjer och faktiskt odla dessa celler i bioreaktor kolvar visades att avsevärt öka den exosome avkastning40. Den medelstora vattenmagasin kontinuerligt levererar näringsämnen till och tar bort avfall från cell kupén genom ett 10 kDa halvgenomträngligt membran, så att långvarig kultur utan att kräva en stor volym av medium kommer i kontakt med celler eller regelbunden kolvar som förändras, vilket i slutändan kan spara den totala kostnaden och labor hög skala exosome produktion40. Det visades också att morfologi samt fenotyp och immunmodulerande funktioner exosomes isolerade celler långsiktiga bioreaktor kolvar kulturer är liknande den från celler odlade i regelbundna 75 cm2 kolvar40. Kultur av andra förevigat cellinjer som exosome källor i bioreaktor kolven skulle därför bidra till att öka deras exosome avkastning samtidigt bibehålla sin integritet och funktion. Denna form av kultur är emellertid inte tillämpliga på primära celler med begränsad division cykler, och de som inte kan vara odlade i hög densitet.
Eftersom skörden i GH görs varje vecka, och celler i kultur var aldrig överförda, kan det antas att cellerna i bioreaktor kolven inte växer på en enskiktslager som regelbundna cellkulturen. De är mest sannolikt att bilda kluster med nekrotisk centra, eller helt enkelt loss från ytan och dör när cellerna är alltför konfluenta för en enskiktslager. Okulärbesiktning av cell facket i bioreaktor kolven går inte att bekräfta detta antagande, men återspeglas av det stora antalet döda celler som erhållits under CM skörd. Regelbunden borttagning av dåligt vidhäftande och icke-viabla celler från bioreaktor kolven kan förhindra uppbyggnaden av material på halvgenomträngligt membran som kan inverka negativt på utbytet av gas, näringsämnen och avfall mellan cell facket och mediet reservoar, vilket möjliggör långvarig kultur i bioreaktor kolvar för > 6 månader40. I detta sammanhang denna icke-regelbundenhet av celltillväxt i bioreaktor kolvar är idealisk som vi spekulerar att det härmar skick faktiskt tumör tillväxt i vivo närmare än konventionella enskiktslager cellkulturen, och förhoppningen är att exosomes producerad av cancer celler i bioreaktor kolven skulle likna mer som utsöndras av tumörer i vivo. Detta skulle vara särskilt fördelaktigt i studier som undersöker rollen av tumör-derived exosomes i förloppet av tumör patologin. Tumör-derived exosomes har rapporterats till egensäkra och företrädesvis hem till deras vävnad av ursprung32, därför att exosomes som produceras i ett system som härma deras i vivo produktion vore också önskvärt i studier utforska exosomes passiv inriktning förmåga som drog nanocarriers.
Trucker förhållandet rapporterades som en parameter att bedöma renheten av isolerade exosomes från att förorena proteiner från odlingssubstratet fysiologiska vätskor där exosomes hade sitt ursprung från41. Trucker förhållandet mellan 8,3 ± 1,7 × 1010 p/µg erhölls i denna studie faller inom intervallet hög renhet som föreslås i studien. Detta förhållande belyser faran med att använda proteinkoncentration för att uttrycka den avkastning eller dos av exosomes isolerade eller används i efterföljande studier respektive, eftersom detta inte återspeglar den verkliga mängden exosomes tillgängliga i provet med tanke på problemet med protein kontaminering under isolering. NTA via instrument såsom NanoSight, som mäter koncentrationen av exosomes i form av partikeln numrerar, är ett mer förnuftigt och korrekt sätt att kvantifiera exosomes.
Mycket noggrann vägning under utarbetandet av de 25% sackaroslösning i deuteriumoxid är viktigt eftersom denna metod är en densitet-baserade isolering. Exosomes har ett ganska smalt utbud av flotation densitet i sackaroslösning så korrekt beredning av sackaros dynan kommer att minska förorening av icke-exosomal blåsor såsom apoptotiska kroppar eller Golgi-derived blåsor under isolering42. Det rekommenderas inte att hålla överblivna sackaroslösning och använder det även efter en dag för att undvika risk för faktorer som kan förändra dess täthet såsom förlust eller tillsats av vatten i lösningen genom avdunstning eller kondens luft i röret. Användning av en swing-out rotor är också viktigt under centrifugering på sackaros dynan att låta även migration av exosomes från CM sackaroslösning.
Återkalla sackaros lösning efter centrifugering är också en delikat steg, och det handlar om att hitta en kompromiss mellan att maximera mängden exosomes återvunna och inte alltför mycket att protein från odlingssubstratet införs i exosome urvalet dras tillbaka . Gränssnittet mellan sackaros lösningen och det skick mediet är där proteiner från odlingssubstratet skulle samla efter centrifugering, och kan oftast ses som en mörk brun ring som sitter på gränssnittet. I våra händer är uttag 2 mL av sackaros dynan från den inledande 3 mL som tillsätts den optimala volym som håller med den kompromiss som nämns ovan. De volymer som beskrivs i detta protokoll är för specifika rotorerna används; Därför är det klokt att optimera volymen av sackaros kan dras tillbaka när skala upp eller ner volymerna för typer av rotorer tillgängliga i olika anläggningar. Det är också viktigt att undvika området rätt i mitten av botten av röret när återkalla sackaros, eftersom det är där partiklar av högre densitet än sackaros kommer sediment och kan oftast ses som en benvit pellet.
Tvätt steget med en relativt stor mängd PBS hjälper till att ytterligare minska graden av protein kontaminering under exosome isolering41. Detta steg är också viktigt i att ta bort överflödig sackaros från exosomes för att undvika osmotisk skador på exosomes själva eller biomolekyler inom exosomal lumen, samt minska risken för bakterie eller svamp tillväxt i exosome materiel. Beredning av sackaros i deuteriumoxid snarare än vatten hjälper till att reducera mängden sackaros som behövs för att uppnå exosome flotation densiteten för isolering, därmed minska risken för både osmotisk skador och mikrobiell kontamination. Efter den första centrifugeringen på sackaros dynan, den exosome som innehåller sackaros lager återkallat och lagt till PBS kan lagras vid 4 ° C och bearbetas följande dag om inför tidsbegränsningar.
Till bäst av vår kunskap är exosome/siRNA molar förhållandet en viktig faktor vid fastställandet av elektroporation effektivitet. I detta protokoll använde vi 1:60 som exosome till siRNA molar förhållandet. Inkapsling förmågan hos olika typer av exosomes är olika, rekommenderar vi starkt detta optimeras på fall-till-fall basis. Inkapsling effektivitet föreslås häri kan dock alltid vara en parameter för att välja de optimala elektroporation villkor.
Dessutom är aggregering av siRNA tros vara en av de vanligaste problemet i elektroporation. Det är bevisat att elektroporation kan framkalla stark aggregering av siRNA, vilket gör det ännu svårare att ange exosomes. siRNA aggregeringar tolkas ofta felaktigt som inkapsling av siRNA i exosome därför ordentliga kontroller användes i denna studie som bildandet av siRNA aggregat är oundvikligt under elektroporation28. Procentandel inkapsling effektiviteten i våra reningsmetod beräknades med hjälp av normaliserade värden för att minimera påverkan från andra källor såsom bakgrund buller, exosome och siRNA aggregeringar som skulle påverka datatillförlitlighet. Baserat på våra resultat, var det försumbar siRNA aggregeringar observerades i den kontroll provet dvs med electroporated och un-electroporated siRNA.
Detta protokoll har framgångsrikt visat inkapsling av siRNA in exosomes och deras efterföljande intracellulära leverans av siRNA till cancer celler in vitro. Olika typer av exosomes från olika cellinjer kan därför vara isolerade och kännetecknas med föreslagna protokollet och därefter laddad med olika terapeutiska siRNA för olika typer av onkogena mål över uttryckt i olika cancerformer. En intressant tillämpning skulle vara att utforska siRNA delivery och upptag effektivitet använder olika permutationer av exosome källa-mål cell par in vitro. Detta kan sedan översättas till djurmodeller att bedöma effektiviteten i både leverans och terapeutiska effektivitet siRNA-inkapslat exosomes invivo.
The authors have nothing to disclose.
F. N. Faruqu finansieras av Malaysias regering byrån Majlis Amanah Rakyat (MARA). L. Xu är mottagare av den Marie Sklodowska-Curie stipendier (Horisont 2020) (H2020-behöriga myndigheters-om-2016). K. T. Al-Jamal erkänner finansiering från BBSRC (BB/J008656/1) och Wellcome Trust (WT103913). Författarna vill även tacka Dr Paul Lavender och Dr David Fear (avdelningen för Lungmedicin och allergi, King’s College London) för den som tillhandahåller electroporator.
Material | |||
Sterile Newborn Calf Serum Heat Inactivated | First Link | 08-05-850 | 500 ml |
EMEM medium | Thermo Fisher Scientific | 11090081 | 500 ml |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | 100 ml |
GlutaMax | Thermo Fisher Scientific | 35050-038 | 100 ml |
Sucrose | Fisher Scientific | S/8600/60 | 1 kg |
Deuterium oxide (D2O) | Sigma-Aldrich | 151882 | 250 g |
1X Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010015 | 500 ml |
Glycine | VWR Chemicals | 101196X | 1 kg |
Sepharose CL-2B | GE Healthcare Life Sciences | 17-0140-01 | 1 L; Particle Size 60 μm-200 μm |
Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300096 | 100 ml |
Aldehyde/sulfate latex beads | Thermo Fisher Scientific | A37304 | 4% w/v, 4 µm, 15 ml |
MicroBCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23235 | |
CD81 antibody (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-0819-42 | Lot: E15950-104. RRID: AB_11150235. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD81 isotype (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-4714-81 | Lot: 4291563. RRID: AB_763650. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD9 antibody (FITC) | Thermo Fisher Scientific | 11-0098-41 | Lot: 4345870. RRID: AB_10698007. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD9 isotype (FITC) | Thermo Fisher Scientific | 11-4714-41 | Lot: 4299784. RRID: AB_10598647. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD63 antibody (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-0639-41 | Lot: 1930435. RRID: AB_2572564. 1:10 dilution in 50 µl sample |
CD63 isotype (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-4714-81 | Lot: 1937696. RRID: AB_470059. 1:10 dilution in 50 µl sample |
Atto655-siRNA | Eurogentec | SQ-SIRNA | (Labelled-S) UGC-GCU-ACG-AUC-GAC-GAU-G55; (Unlabelled-AS) CAU-CGU-CGA-UCG-UAG-CGC-A55. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm | Millipore | SLGP033RS | |
CELLine AD1000 bioreactor flasks | Wheaton | WCL1000ad | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-80 | |
Swing-out rotor | Beckman Coulter | SW45 Ti | |
Fixed-angle rotor | Beckman Coulter | Type 70 Ti | |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355631 | Polycarbonate. Max. fill 32 ml |
Ultracentrifuge bottles | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate. Min. fill 16 ml, max. fill 25 ml |
NanoSight | Malvern | LM10 | Software: NanoSight NTA v3.2 |
Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Plate reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
Flow cytometry tubes | BD Biosciences, Falcon | 352052 | |
Microfuge tubes | Starlab | S1615-5500 | 1.5 ml |
Cell culture flasks | Fisher Scientific | 156499 | 75 cm2 |
Transmission electron microscope | FEI Electron Optics | Philips CM 12 | with Tungsten filament and a Veleta – 2k × 2k side-mounted TEM CCD Camera (Olympus, Japan) |
Amaxa Nucleofector I | Lonza | Nucleofector I | with Amaxa’s Nucleofector Kits |
24-well flat-bottom plates | Corning | Costar | |
Blunt fill needle | BD Biosciences | 305180 | 18G x 1 1/2" (1.2 mm x 40 mm) |
Glass pipettes | Fisher Scientific | 1156-6963 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | Composition | ||
Normal medium | Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% foetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax. | ||
Exosome-depleted medium | Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% exosome-depleted FBS (see below), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax. | ||
Exosome-depleted FBS | Subject FBS to ultracentrifugation at 100,000 g for 18 h at 4°C. The FBS supernatant post-centrifugation was collected and sterile-filtered using 0.22 µm filters. | ||
25% w/w sucrose cushion | Add 1.9 g (± 0.001 g) of sucrose in a universal tube, and top up with D2O until the weight reaches 7.6 g (± 0.001 g). This makes ~6ml of the 25% w/w sucrose cushion. | ||
3% FBS/PBS | Add 1.5 ml exosome-depleted FBS to 48.5 ml 1X PBS to prepare 50 ml of 3% FBS/PBS. | ||
100 µM BSA solution | Prepare 1mM BSA solution by adding 0.3325 g to 50 ml PBS. Make 1:10 dilution of this stock to obtain 100 µM BSA solution. Make 5-10 µl aliqouts of this 100 µM BSA solution (for single use) and store them at -20°C. All BSA solution should be stored at -20°C, and discard solutions that have undergone ≥2 freeze-thaw cycles. | ||
100 mM glycine solution | Add 0.375 g of glycine to 50 ml PBS to obtain 100 mM glycine solution, store at 4°C. | ||
Citric acid buffer with EDTA | Mix 0.1954 g citric acid and 0.2087 g disodium phosphate in 50 mL of deionised water. Add EDTA to 0.1 mM. Adjust pH to 4.4. | ||
Fixing solution | Prepare formaldehyde/glutaraldehyde, 2.5% (w/v) each in 0.1 M sodium cacodylate buffer, and adjust pH to 7.4. | ||
Aqueous uranyl acetate | Prepare 25% (v/v) uranyl acetate in methanol. | ||
50% methanol/H2O | Mix methanol and H2O 1:1 (v/v). | ||
SEC Column packed with Sepharose CL-2B | Dilute 37.5 ml Sepharose CL-2B resin with 12.5 ml PBS to obtain 75% Sepharose CL-2B solution. Pour the Sepharose CL-2B solution into a column of dimension 2.9 cm [H] x 1.3 cm [W]. Pour the Sepharose CL-2B to 3-4 mm above the stated height, and then press it down to the stated height with the filter for optimal packing. |