Her præsenterer vi to protokoller, en til at måle den specifikke vækstrate og den anden for celle-bindende evne af rotavirus ved hjælp af plaque assay og RT-qPCR. Disse protokoller er tilgængelige for at bekræfte fænotyper forskellene mellem rotavirus stammer.
Rotavirus er den største ætiologiske faktor for infantile diarré. Det er en dobbelt-strenget (ds) RNA-virus og danner en genetisk forskellige befolkning, kendt som quasispecies, på grund af deres høje Mutationshastighed. Her, beskriver vi hvordan man kan måle den specifikke vækstrate og celle-bindende evne af rotavirus som sin fænotyper. Rotavirus er behandlet med trypsin at genkende celle receptoren og derefter inokuleres i MA104 cellekultur. Supernatanten, herunder viral descendenter, er indsamlet sporadisk. Plaque analysen bruges til at bekræfte virus titer (plak-dannende enhed: pfu) af hver indsamlet supernatanten. Den specifikke vækstrate anslås ved at montere tidsforløb data på pfu/mL, den modificerede Gompertz model. I analysen af celle-bindende er MA104 celler i en 24-godt plade inficeret med rotavirus og inkuberes i 90 min. ved 4 ° C for rotavirus adsorption til cellereceptorer. Lav temperatur når den tilbageholder rotavirus fra invaderende vært-cellen. Efter vask for at fjerne ubundne virioner, er RNA udvundet af virioner tilknyttet cellereceptorer efterfulgt af cDNA syntese og omvendt-transskription kvantitativ PCR (RT-qPCR). Disse protokoller kan anvendes for at undersøge de fænotypiske forskelle blandt viral stammer.
RNA-vira danne en genetisk forskellige befolkning, kendt som quasispecies1, på grund af deres Mutationshastighed,2 som er højere end i DNA-baserede organismer. Befolkningsstrukturen i quasispecies påvirkes af befolkningen genetiske faktorer, herunder mutation, udvælgelse pres og genetisk drift. Stammer inden for en enkelt genetiske afstamning kan vise forskellige fænotyper på grund af den genetiske mangfoldighed. For eksempel viste Rachmadi et al., fri klor følsomhed var forskellig blandt murine norovirus stammer, der stammer fra en plaque-renset stamme S7-PP33.
Rotaviruses (slægten rotavirus i reoviridae familie) er ikke-kappebærende ds RNA virus danner quasispecies2. Ud over de befolkning genetiske faktorer beskrevet ovenfor, påvirker genom resortering den genetiske mangfoldighed af rotavirus fordi denne virus har 11 segmenterede genomer4. Rotaviruses forårsage diarré hovedsageligt blandt spædbørn, og børnedødelighed i 2013 blev anslået omkring 250.0005. To vacciner er i brug i flere lande og har været effektive til at reducere byrden af rotavirus-infektion, men nogle forskere diskuterer nu tilstedeværelsen af vaccine-undslippe mutanter6,7,8, 9. karakterisering af disse mutanter er vigtigt at forstå mekanismerne, vaccine-escape.
Vi præsenterer her, protokoller for to assays til evaluering af specifikke vækstrate og celle-bindende evne af rotavirus for at forstå de fænotypiske forskelle blandt stammer/mutanter. Vækstkurven af rotaviruses har været præsenteret i tidligere rapporter10, men vækst parametre såsom-specifik tilvækst er normalt ikke måles. En celle-bindende analyse gennemført tidligere indebærer den immunfluorescent farvning teknik11. Her viser vi lettere metoder til brug af plaque assay og RT-qPCR, som tillader os at kvantitativt diskutere forskellen i viral fænotyper. Disse metoder er hensigtsmæssige for karakterisering af rotavirus fænotyper og kan endelig bidrage til opbygningen af nye vacciner effektiv for flere genotyper.
Vores protokol til måling af de specifikke vækstrate er lettere end tidligere og kan tilpasses til andre vira, medmindre deres celle kultur system endnu ikke er blevet etableret. I denne undersøgelse, brugte vi RRV (G3P[3]) fordi denne stamme kan danne plaques lettere end menneskelige rotaviruses når du bruger MA104 cellelinjer. Nogle menneskelige rotavirus stammer ikke kan danne plak i denne cellelinje. Derfor, i stedet for analysen plaque fokus danner enhed (FFU) assay15 eller median vævskultur infektiøse dosis (TCID50) analysen kan anvendes til mange rotavirus stammer16. Den præsenterede protokol til bestemmelse af de specifikke vækstrate kan bruges til andre virustyper men er ikke egnet til vira som ingen etableret celle kultur system er etableret. Før du starter eksperimentet for den specifikke vækstrate, det er bedre at vide på forhånd, når virus smitsom titer begynder at stige og når den stationære fase i en foreløbig prøve. Hvis for mange plaques er til stede, bør plaque analysen udføres igen efter skiftende fortynding satsen af virus prøver. Timer efter infektionen (hpi) til at indsamle prøver er også vigtige, fordi hældningen af den eksponentielle vækstfase kan være undervurderet, hvis den rette tidspunkt at nå frem til den stationære fase er savnet. I tilnærmelsen af den modificerede Gompertz model, bør en determinationskoefficienten altid beregnet og tjekket. Hvis fitness til den modificerede Gompertz model er lav, kan andre vækst modeller såsom modificeret logistisk model12 være at foretrække.
I håndtering celler, når du fjerner medium eller virus inokulat, skal PBS for vask eller Agarosen gel for plaque assay straks tilføjet til hver godt af en celle kultur plade til at forhindre celler fra tørhed. På samme tid, skal du forsigtigt hældes PBS eller Agarosen celler ikke at løsrive fra brøndene. Dette trin er det vigtigste i begge assays (trin 3,9 og 3.11). Hvis plak analysen har for mange prøver, anbefaler vi inddele agarosegel (100 mL hver maksimalt anbefales) i flere mellemstore flasker og holde flaskerne varme indtil lige før brug siden Agarosen gel er størknet i ca 10 min på værelse temperatur. Da trypsin er sårbare over for høje temperaturer17, bør en trypsin løsningen føjes til en medium og Agarosen for plaque analysen efter passende afkøling.
I celle-bindende assay, skal inkubation i virus binding til celler gøres ved 4 ° C at forhindre invasion af celler. Ifølge Gillings metode13er celler tilbøjelige til tørring ved lave temperaturer, så blid ryster er nødvendigt hvert 15 min under inkubation. RNA udvinding kit udnyttet her kan erstatte andre kits. Hældningen af standardkurven i RT-qPCR bør være ca 3.3, og determinationskoefficienten bør være mere end 0,98. I forhold til fluorescens mikroskop til at visualisere lokalisering af virus i celler, er analysen hurtigere og nemmere at bruge fordi binding af fluorescerende stoffer til vira ikke er nødvendigt.
For nylig, menneskelige tarm enteroid (HIE), udviser en lignende cellulære sammensætning og funktion som menneskelige mave-tarm epitel, er blevet tilgængelig for rotavirus formering18. Brugen af HIE kan gøre det muligt at evaluere de specifikke vækstrate og celle-bindende evne til ikke-bestemmelse stammer af rotavirus. Også, begge forsøg beskrives her kan anvendes til evaluering af narkotika virkninger på begge fænotyper19. Protokollerne præsenteres her gøre det muligt at kvantitativt diskutere ændringer i fænotype parameterværdier af rotavirus stammer under varierede forhold.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af “The sanitet værdi kæden: designe sanitet systemer som Eco-værdi fællesskabssystemet” projekt, forskningsenhed for menneskeheden og naturen (RIHN, projekt No.14200107).
7500 Real Time PCR System | Applied Biosystems | qPCR | |
Agar-EPI | Nakalai Tesque, Inc | 01101-34 | Plaque assay |
Disodium Hydrogenphosphate | Wako Pure Chemical Corporation | 194-02875 | Cell binding assay |
Eagle's MEM "Nissui" | Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05900 | Cell culture |
Eagle's MEM "Nissui" | Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05901 | Plaque assay |
EasYFlask 75 cm2 | Thermo Scientific | 156499 | Cell culture |
Fetal bovine Serim, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 10437028 | Cell culture and Plaque assay |
Forward / Reverse primers | Eurofins Genomics | qPCR | |
L-Glutamine, 200 mM Solution | Gibco | 2530081 | Cell culture and Plaque assay |
Neutral Red | Wako Pure Chemical Corporation | 140-00932 | Plaque assay |
PBS (-) "Nissui" | Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05913 | Cell culture and Plaque assay |
Penicillin-Streptomycin, Liguid | Gibco | 15140122 | Cell culture and Plaque assay |
Potassium Chloride | Wako Pure Chemical Corporation | 163-03545 | Cell binding assay |
Premix ExTaq (Perfect Real Time) | TAKARA Bio Inc. | RR039A | qPCR |
PrimeScriptTN RT reagent Kit (Perfect Real Time) | TAKARA Bio Inc. | RR037A | cDNA synthesis |
PrimeTime qPCR Probes | Medical and Biological Laboratories Co., Ltd. | qPCR | |
QIAamp Viral RNA Mini Kit | QIAGEN | 52904 | RNA extraction |
Sodium Bicarbonate | Wako Pure Chemical Corporation | 199-05985 | Cell culture and Plaque assay |
Sodium Chloride | Wako Pure Chemical Corporation | 198-01675 | Cell binding assay |
Tissue culture plates 24-well plate | TPP | 92024 | Cell binding assay |
Tissue culture plates 6-well plate | TPP | 92006 | Plaque assay |
Trizma base | SIGMA-ALDRICH | T1503 | Cell binding assay |
Trypsin from porcine pancrease | SIGMA-ALDRICH | T0303-1G | Activate for rotavirus |
Trypsin-EDTA (0.05 %), phenol red | Gibco | 25300054 | Cell culture |
Vertical 96-Well Thermal Cycler | Applied Biosystems | cDNA synthesis |