Här presenterar vi två protokoll, en för att mäta den specifika tillväxttakten och den andra för rotavirus med hjälp av plack assay och RT-qPCR cell-bindande förmåga. Dessa protokoll finns tillgängliga för att bekräfta skillnaderna i fenotyper mellan rotavirus stammar.
Rotavirus är den viktigaste etiologiska faktorn för infantil diarré. Det är en dubbelsträngat (ds) RNA-virus och bildar en genetiskt olika befolkning, känd som quasispecies, på grund av deras höga mutationshastighet. Här, beskriver vi hur man mäter specifika tillväxttakten och cell-bindande möjligheten av rotavirus som dess fenotyper. Rotavirus är behandlade med trypsin att erkänna cell receptorn och sedan inokuleras i MA104 cellkultur. Supernatanten, inklusive viral avkommor, samlas in periodvis. Plack analysen används för att bekräfta virus titern (plaque-forming unit: pfu) av varje insamlade supernatanten. Den specifika tillväxten uppskattas av passande tid-bandata pfu/ml till den modifierade Gompertz modellen. I analysen av cell-bindande, är MA104 celler i en 24-well platta infekterade med rotavirus och inkuberas i 90 minuter vid 4 ° C för rotavirus adsorption till cellreceptorer. En låg temperatur hindrar rotavirus från invaderande värdcellen. Efter tvättning för att avlägsna obunden virioner, ur RNA virioner bifogas cellreceptorer följt av cDNA syntes och omvänd-Transkription kvantitativ PCR (RT-qPCR). Dessa protokoll kan användas för att utreda de fenotypiska skillnaderna mellan virusstammar.
RNA-virus utgör en genetiskt olika population, känd som quasispecies1, på grund av deras mutationshastighet,2 som är högre än för DNA-baserade organismer. Befolkningsstruktur i quasispecies påverkas av befolkningens genetiska faktorer, inklusive mutation, selektionstryck och genetisk drift. Stammar inom en enda genetiska härstamning kan visa olika fenotyper på grund av den genetiska mångfalden. Rachmadi et al. visade till exempel att fritt klor känslighet var annorlunda bland murina norovirus stammar som härstammar från en plack-renat stam S7-PP33.
Rotavirus (släkte rotavirus i reoviridae familj) är icke-höljebärande ds RNA virus bildar quasispecies2. Utöver befolkningen genetiska faktorer som beskrivs ovan, påverkar genomet genvariation den genetiska mångfalden av rotavirus eftersom detta virus har 11 segmenterade genomen4. Rotavirus orsakar diarré främst bland spädbarn och spädbarn dödsfall i 2013 uppskattades ca 250.0005. Två vacciner används i flera länder och har varit effektiva för att minska bördan av rotavirusinfektion, men vissa forskare nu diskuterar förekomsten av vaccinet-escape mutants6,7,8, 9. karakterisering av dessa mutanter är viktigt att förstå mekanismerna som vaccin-escape.
Här presenterar vi protokoll för två analyser för utvärdering av tillväxthastighet och cell-bindande förmåga av rotavirus för att förstå de fenotypiska skillnaderna bland stammar/mutanter. Tillväxtkurvan av rotavirus har presenterats i tidigare rapporter10, men tillväxten parametrar såsom tillväxthastighet mäts inte vanligtvis. En cell-bindande analysen genomförs innebär tidigare Immunofluorescerande färgning teknik11. Vi visar här enklare metoder för att använda den plack assay och RT-qPCR, som tillåter oss att kvantitativt diskutera skillnaden i viral fenotyper. Dessa metoder är lämpliga för karakterisering av rotavirus fenotyper och kan slutligen bidra till byggandet av nya vacciner effektivt för flera genotyper.
Våra protokoll för mätning av den specifika tillväxttakten är lättare än tidigare och kan anpassas för andra virus såvida deras cellodlingssystem inte har ännu fastställts. I denna studie använde vi RRV (G3P[3]) eftersom denna stam kan bilda plack lättare än humant rotavirus när du använder MA104 cellinjer. Vissa humant rotavirus stammar kan inte bilda plack i denna cellinje. Därför i stället för plack analysen, kan fokus bildar (FFU) analys15 eller median vävnadsodling smittsamma enhetsdos (TCID50) analys tillämpas för många rotavirus stammar16. Presenterade protokollet för att fastställa specifika tillväxt kan användas för andra virustyper men är inte lämplig för virus för vilka inga etablerade cellodlingssystem är etablerad. Innan du börjar experimentet för specifika tillväxten, det är bättre att veta i förväg när viruset smittsamt titern börjar öka och når den stationära fasen i ett preliminärt test. Om det finns alltför många plack bör plack analysen utföras igen efter att ha ändrat spädning av de virus proverna. Timmar efter infektionen (hpi) att samla in prover är också viktiga eftersom lutningen på exponentiella tillväxtfasen kan underskattas om den rätta tidpunkten att nå den stationära fasen är missat. Genom en tillnärmning av den modifierade modellen Gompertz, bör alltid en determinationskoefficienten beräknas och kontrolleras. Om lämplighet att modifierade Gompertz modellen är låg, kan andra tillväxtmodeller såsom den modifierade logistiska modell12 vara att föredra.
Vid hantering av celler, när du tar bort det medium eller virus inokulatet, PBS för tvättning eller agaros gel för plack assay omgående måste läggas till varje väl av en cell kultur plattan att förhindra celler från torrhet. Samtidigt, måste du försiktigt hälla PBS eller agaros till celler inte att lossna från brunnar. Detta steg är det viktigaste i båda analyser (steg 3.9 och 3.11). Om plack analysen har alltför många prover, rekommenderar vi dela upp agarosgel (100 mL varje maximalt rekommenderas) i flera medelstora flaskor och varmhållning flaskorna förrän strax före användning sedan agaros gel är stelnat ca 10 min. på room temperatur. Eftersom trypsin är utsatta för höga temperaturer17, bör en trypsin-lösning läggas till ett medium och agarosgelelektrofores för plack analysen efter adekvat nedkylning.
I cell-bindande analysen, måste inkubationstiden för virus bindning till celler göras vid 4 ° C att förhindra invasionen av cellerna. Enligt Gillings metod13är cellerna benägna att torka vid låga temperaturer, så varsam skakning är nödvändigt varje 15 min under inkubation. I RNA extraktion kit utnyttjas här kan ersätta andra kit. Lutningen på standardkurvan i RT-qPCR bör vara cirka 3,3 och determinationskoefficienten bör vara mer än 0,98. Analysen jämfört med fluorescens Mikroskop att visualisera localizationen av virus i celler, och är snabbare och enklare att använda eftersom bindningen av fluorescerande ämnen att virus inte är nödvändigt.
Nyligen, human intestinal enteroid (HIE), uppvisar en liknande cellulära sammansättning och funktion som mänskliga mag epitel, blivit tillgänglig för rotavirus förökning18. Användning av HIE kan göra det möjligt för oss att utvärdera tillväxthastighet och cell-bindande förmåga av icke-odlingsbara stammar av rotavirus. Också, båda experimenten som beskrivs här kan tillämpas på utvärdering av läkemedelseffekter på båda fenotyper19. De protokoll som presenteras här gör det möjligt att kvantitativt diskutera förändringar i fenotyp parametervärdena för rotavirus stammar under varierande förhållanden.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av ”sanitet värde kedjan: designa sanitet system som Eco-Community värde systemet” projekt, ResearchInstitute för mänskligheten och naturen (RIHN, projektet No.14200107).
7500 Real Time PCR System | Applied Biosystems | qPCR | |
Agar-EPI | Nakalai Tesque, Inc | 01101-34 | Plaque assay |
Disodium Hydrogenphosphate | Wako Pure Chemical Corporation | 194-02875 | Cell binding assay |
Eagle's MEM "Nissui" | Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05900 | Cell culture |
Eagle's MEM "Nissui" | Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05901 | Plaque assay |
EasYFlask 75 cm2 | Thermo Scientific | 156499 | Cell culture |
Fetal bovine Serim, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 10437028 | Cell culture and Plaque assay |
Forward / Reverse primers | Eurofins Genomics | qPCR | |
L-Glutamine, 200 mM Solution | Gibco | 2530081 | Cell culture and Plaque assay |
Neutral Red | Wako Pure Chemical Corporation | 140-00932 | Plaque assay |
PBS (-) "Nissui" | Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05913 | Cell culture and Plaque assay |
Penicillin-Streptomycin, Liguid | Gibco | 15140122 | Cell culture and Plaque assay |
Potassium Chloride | Wako Pure Chemical Corporation | 163-03545 | Cell binding assay |
Premix ExTaq (Perfect Real Time) | TAKARA Bio Inc. | RR039A | qPCR |
PrimeScriptTN RT reagent Kit (Perfect Real Time) | TAKARA Bio Inc. | RR037A | cDNA synthesis |
PrimeTime qPCR Probes | Medical and Biological Laboratories Co., Ltd. | qPCR | |
QIAamp Viral RNA Mini Kit | QIAGEN | 52904 | RNA extraction |
Sodium Bicarbonate | Wako Pure Chemical Corporation | 199-05985 | Cell culture and Plaque assay |
Sodium Chloride | Wako Pure Chemical Corporation | 198-01675 | Cell binding assay |
Tissue culture plates 24-well plate | TPP | 92024 | Cell binding assay |
Tissue culture plates 6-well plate | TPP | 92006 | Plaque assay |
Trizma base | SIGMA-ALDRICH | T1503 | Cell binding assay |
Trypsin from porcine pancrease | SIGMA-ALDRICH | T0303-1G | Activate for rotavirus |
Trypsin-EDTA (0.05 %), phenol red | Gibco | 25300054 | Cell culture |
Vertical 96-Well Thermal Cycler | Applied Biosystems | cDNA synthesis |