細胞内カルシウムと新鮮な分離とそのままマウス脳血管内皮細胞の膜電位の同時計測
Summary
ここで説明は、(1) たてそのまま脳血管内皮「チューブ」と内皮細胞のカルシウムと膜内皮由来過分極電位 (2) 同時計測を隔離するためのプロトコルです。さらに、これらのメソッド内皮細胞カルシウムと個々 またはインタラクティブな実験変数として電気シグナリングの薬理学的チューニングを可能にします。
Abstract
脳動脈および彼らのそれぞれの微小循環血流調節を介して脳に酸素と栄養を提供します。神経細胞の代謝需要を満たすために必要に応じて血管内皮細胞の血管と血管径に変更するコマンドのルーメンを行します。過分極膜電位 (Vm) と窒素酸化物の主な内皮依存性シグナル経路は、通常血管拡張反応を仲介し、それにより血流を増加する並列で動作します。血管の長さ数ミリの血管拡張反応の調整には不可欠な内皮由来過分極 (EDH) のコンポーネントされている歴史的に測定することは困難。EDH のこれらのコンポーネントは細胞内 Ca2 + [Ca2 +]私が増加との小規模でその後活性化を伴うし、中間コンダクタンス Ca2 +-K+を活性化 (SKCa/IKCa) チャンネル。
ここでは、提案するマウス脳動脈から新鮮な内皮細胞の分離の簡略図内皮 [Ca2 +]私と Vmそれぞれ Fura 2 測光と細胞内の鋭い電極を使用しての同時測定塩水濃度および生理学的な条件 (pH 7.4 では、37 ° C) の下で薬剤の継続的なスパーフュー ジョン法。ウィリス動脈輪から後大脳動脈が削除されます, 通信と脳底動脈の無料。洗浄後大脳動脈セグメントとその後製粉の酵素の消化力は、外膜、血管周囲神経や平滑筋細胞の除去を促進します。結果後大脳動脈内皮「チューブ」は、顕微鏡下では、保護し、カメラ、光電子増倍管、連続スパーフュー ジョン法を受けながら、1 〜 2 electrometers を用いています。総称して、このメソッドことができますと同時に測定内皮 [Ca2 +]私の変化に沿ってそのまま距離をミリ波までのギャップ結合を介した EDH の広がりに加え、離れた細胞場所で Vm血管内皮細胞。このメソッドは、高スループット分析の正常および病的脳血流調節機構の基礎となる脳の血管内皮機能をもたらすと予想されます。
Introduction
脳全体の血流は、中大脳動脈と細動脈血管ネットワーク1で血管拡張反応の調整によって規制されています。血管内皮細胞は、脳の抵抗動脈ニューロン1,2,3の代謝需要を満たすために必要に応じて血管径に変更するコマンドをライニングします。(通称 EDH)、内皮由来過分極反応の中に特に、細胞内 Ca2 + ([Ca2 +]私) 内皮細胞座標血管内皮細胞間の電気信号と、動脈弛緩4のギャップ結合を介した周囲の平滑筋細胞。EDH の生理開始は順次 Gqの刺激を伴います-受容体 (Gpcr) [Ca2 +]私との内皮小中間 Ca2 +活性化の増加を結合-アクティブに K+(SKCa/IKCa) hyperpolarize 脳血管内皮膜電位 (Vm)5,6,7チャンネル。したがって、内皮 [Ca2 +]私と Vmの親密な関係は血の流れの調節に不可欠な心臓・脳血管の機能6、8に欠かせない。広範な文献の中で多くの研究 (例えば、高血圧、糖尿病、心不全、冠動脈疾患、慢性腎不全、慢性疾患の整備に血管内皮機能障害の関連を報告しています。末梢動脈疾患)9,10、生理学的、病理学的条件の血管内皮機能を勉強の意義を示します。
血管内皮細胞が過分極、血管拡張、および組織灌流の生産に不可欠である、したがって、そのネイティブの細胞特性の検討は重要です。一般的な研究モデルとして骨格筋11,12, 腸13、肺14、および最近脳6前にマウスの動脈の内皮の管モデルの準備を公開されています。同時 [Ca2 +]私と Vm測定の研究特に骨格筋動脈内皮15,16としてリンパ管の内皮細胞17公開されています。内皮の管アプローチを利用してプライマリの研究に加えてその長所と短所8の包括的な見直しは、この実験的なツールが特定の調査のために適切であるかどうかに相談ことができます。簡単に言えば、利点は、内皮細胞の機能の主要な生理学的なコンポーネントが保持されます (, Ca2 +流入や細胞内放出、ネルンストの潜在性 Vmの K+の過分極経由でSKCa/IKCa活性化とギャップ結合を介して血管内皮細胞間結合) 血管周囲神経入力、平滑筋の電位依存性チャネルの関数、収縮性などの要因が交絡なし血とホルモンの影響8の循環。対照的に、一般的に使用されるセル文化アプローチ導入形態18とイオン チャネル発現19大きく決定前のヴィヴォ生理学的観察との比較を隠ぺいする方法の重要な変化または生体内で。制限は、このモデルはそのまま血管セグメント分離の 4 h 以内テスト最適平滑筋など実験的スケジュールで制限された柔軟性、血流を規制するその他の重要なコンポーネントとの統合の欠如動物。
ここから新鮮な内皮細胞の分離を示す、Socha とシーガルの12および中間6,15,16, 実験的動向によって以前のビデオ議定書からの構築後大脳動脈と血管内皮 [Ca2 +]私と Vmそれぞれ Fura 2 測光および細胞内の鋭い電極を使用しての同時測定。さらに、この実験は、生理学的な条件 (pH 7.4 では、37 ° C) の間に塩水濃度および薬理学的エージェントの連続的なスパーフュー ジョン法を伴います。それは構造健全性 (細胞のギャップ結合を介した結合) と十分な寸法 (幅: 50 μ m、長さ ≥ 300 μ m) さと内に沿ってとの間で、細胞間情報伝達および孤立した内皮細胞を得られるように選んだ後大脳動脈血管内皮細胞。また、齧歯動物の後大脳動脈の研究の文献で実質的に表され、基本的な内皮細胞シグナル伝達機構、血管開発/老化、そして病理学20,の試験を網羅21,22. この実験的脳血管内皮機能 (機能不全) の高スループット解析に期待し、全体の血液の流れの規制の理解する上で重要な進歩を可能にすることにより加齢と神経変性疾患の開発。
Protocol
Representative Results
Discussion
最近の動向6,15,16,17、照らして今 [Ca2 +] の同時測定のための準備のマウス脳血管内皮細胞を分離する方法を示すiおよび Vm 37 ° C の ~ 2 h を一貫して EDH の基になります。技術的に困難な細胞間の結合も (参照6図 1 を参照) を測定できます。この方法では、離…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
現在のプロトコルに必要な用品を確立している間優秀なテクニカル サポートありがとうチャールズ ・ ヒューイット。我々 はそれぞれ追加の倒立顕微鏡と電位計、私たちを提供するため夫妻ショーン ・ m ・ ウィルソンと LLU 周産期生物学センターからのクリストファー ・ g. ウィルソンをありがとうございます。この研究は、国立衛生研究グラント R00 AG047198 (EJB) そして Loma リンダ大学医学部新学部設立基金によってサポートされています。内容は著者の責任と国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。
Materials
| Glucose | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | G7021 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | |
| CaCl2 | Sigma | 223506 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| NaOH | Sigma | S8045 | |
| ATP | Sigma | A2383 | |
| HCl | ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | A466250 | |
| Collagenase (Type H Blend) | Sigma | C8051 | |
| Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Elastase | Sigma | E7885 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Fura-2 AM dye | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | F14185 | |
| Recirculating chiller (Isotemp 500LCU) | ThermoFisher Scientific | 13874647 | |
| Plexiglas superfusion chamber | Warner Instruments, Camden, CT, USA | RC-27 | |
| Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
| Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm) | Warner Instruments | PM6 or PH6 | |
| Compact aluminum stage | Siskiyou, Grants Pass, OR, USA | 8090P | |
| Micromanipulator | Siskiyou | MX10 | |
| Stereomicroscopes | Zeiss, NY, USA | Stemi 2000 & 2000-C | |
| Fiber optic light sources | Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss | Fostec 8375 | |
| Nikon inverted microscope | Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA | Ts2 | |
| Phase contrast objectives | Nikon Instruments Inc | (Ph1 DL; 10X & 20X) | |
| Fluorescent objectives | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor) | |
| Nikon inverted microscope | Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
| Microsyringe pump controller (Micro4 ) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | SYS-MICRO4 | |
| Vibration isolation table | Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA | Micro-g | |
| Amplifiers | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Axoclamp 2B & Axoclamp 900A | |
| Headstages | Molecular Devices | HS-2A & HS-9A | |
| Function generator | EZ Digital, Seoul, South Korea | FG-8002 | |
| Data Acquision System | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | Digidata 1550A | |
| Audible Baseline Monitors | Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA | BM-A-TM | |
| Digital Storage Oscilloscope | Tektronix, Beaverton, Oregon, USA | TDS 2024B | |
| Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | IonOptix Systems | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B or C | |
| Inline Heater | Warner Instruments | SH- 27B | |
| Valve Controller | Warner Instruments | VC-6 | |
| Inline Flow Control Valve | Warner Instruments | FR-50 | |
| Electronic Puller | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 or P-1000 | |
| Microforge | Narishige, East Meadow, NY, USA | MF-900 | |
| Borosilicate Glass Tubes (Trituration) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | 1B100-4 | |
| Borosilicate Glass Tubes (Pinning) | Warner Instruments | G150T-6 | |
| Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes) | Warner Instruments | GC100F-10 | |
| Syringe Filter (0.22 µm) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
| Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard | Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA | DD-90-S-BLK | |
| Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm) | World Precision Instruments | 555640S, 14364 | |
| Scissors 3 & 7 mm blades | Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA | Moria MC52 & 15000-00 | |
| Sharpened fine-tipped forceps | FST | Dumont #5 & Dumont #55 |
References
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