Summary

शुक्राणु का संग्रह विभेदक गुणवत्ता घनत्व ढाल केंद्रापसारक का उपयोग

Published: November 29, 2018
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Summary

इस पत्र में, हम घनत्व ढाल केंद्रापसारक तकनीक और शुक्राणु फिजियोलॉजी अनुसंधान में अपने आवेदन के प्रदर्शन का वर्णन करने के लिए लक्ष्य ।

Abstract

यौन प्रजनन में, एक महिला gamete के साथ एक पुरुष gamete या शुक्राणु कोशिका फ़्यूज़ निषेचन के बारे में लाने के लिए । हालांकि, निषेचन की क्षमता के साथ शुक्राणु कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या में एक महिला gamete के साथ बातचीत करने के लिए निषेचन सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं । जैसे, व्यक्तिगत शुक्राणु कोशिकाओं के निषेचन की क्षमता सफल प्रजनन के लिए महत्वपूर्ण है । घनत्व ढाल केंद्रापसारक एक reproducible के रूप में कई दशकों के लिए उपयोग किया गया है, तेज, कुशल, प्रभावी और अत्यंत अनुकूलनीय केवल उच्च गुणवत्ता वाले शुक्राणु एकत्र करने के लिए मदद की प्रजनन प्रौद्योगिकी में इस्तेमाल किया जाएगा । प्रोटोकॉल हम वर्णित सतत Percoll घनत्व ढाल केंद्रापसारक (PDGC) तकनीक के उपयोग पर ध्यान केंद्रित करने के लिए उनकी गुणवत्ता से मुर्गा शुक्राणु के तीन अलग आबादी अलग । हम कम, मध्यम और उच्च गुणवत्ता वाले शुक्राणु एकत्र करने में सक्षम थे । हम भी reproducible प्रोटोकॉल का वर्णन है कि उनकी व्यवहार्यता, गतिशीलता और penetrability का आकलन करके शुक्राणु की प्रजनन क्षमता का निर्धारण करना आवश्यक । उनकी गुणवत्ता PDGC तकनीक का उपयोग करके शुक्राणु का संग्रह सही और अच्छी तरह से विभेदक प्रजनन क्षमता के साथ शुक्राणु की विशेषता के लिए उपयोगी होगा ।

Introduction

रीढ़ में, पुरुष gametes गहन चयनात्मक दबाव से गुजरना; इसलिए एक पुरुष के प्रजनन स्वास्थ्य सफल निषेचन प्राप्त करने के लिए निर्णायक है । किसी भी हड्डीवाला प्रजातियों के पुरुषों के लिए बड़ी मात्रा में शुक्राणु कोशिकाओं का उत्पादन और पर्याप्त गुणवत्ता के क्रम में निषेचन की जरूरतों को पूरा करने में सक्षम होना चाहिए । शुक्राणु कोशिकाओं, दोनों एक शुक्राणु सिर और एक flagellum, शरीर में सबसे ध्रुवीय कोशिकाओं रहे हैं । वे भी शुक्राणु की गुणवत्ता में बहुत विषम है (रहते है और मृत, आकृति विज्ञान सामांय और असामांय, और मोबाइल, कम मोबाइल और उच्च मोबाइल), जो पुरुषों की प्रजनन क्षमता में व्यापक भिंनता के माध्यम से पता चला है । बड़े उच्च गुणवत्ता वाले शुक्राणु के अनुपात, कम करने के लिए सफलतापूर्वक डिंब निषेचन के लिए आवश्यक संभोग की संख्या । हालांकि, प्रजनन क्षमता को प्राप्त करने के लिए, आकृति विज्ञान सामांय शुक्राणु कोशिकाओं उनके कशाभिका द्वारा उत्पंन करने के लिए निषेचन के स्थल तक पहुंचने के रूप में अच्छी तरह के रूप में zona pellucida1 (जिला परिषद; स्तनधारियों के मामले में) या भीतरी perivitelline में घुसना बलों पर भरोसा परत2 (IPVL; पक्षियों और सरीसृप के मामले में) के डिंब के बाद प्राकृतिक संभोग या कृत्रिम गर्भाधान (ऐ) । शुक्राणु की गुणवत्ता का निर्धारण सहायता प्राप्त प्रजनन प्रौद्योगिकियों में उपयोग के लिए आवश्यक है3 (कला) और प्रजनन पुरुषों के चयन ऐ कार्यक्रम4में इस्तेमाल किया जाएगा । दूसरी ओर, कला की सफलता केवल शुक्राणु की गुणवत्ता का सही मूल्यांकन पर निर्भर करता है । प्रयोगशाला परीक्षणों के एक नंबर शुक्राणु के कार्यात्मक विशेषताओं का निर्धारण करने के लिए विकसित किया गया है. सबसे महत्वपूर्ण मापदंडों शुक्राणु आकृति विज्ञान, व्यवहार्यता, गतिशीलता, समाई (एवियन शुक्राणु समाई5की आवश्यकता नहीं है), acrosome प्रतिक्रिया (AR; exocytosis और शुक्राणु सिर के acrosome से एक proteolytic एंजाइम की रिहाई), शुक्राणु जिला परिषद या IPVL के प्रवेश, और निषेचन6,7,8,9,10,11। अकेले प्रजनन के उपाय एक शुक्राणु जनसंख्या11के निषेचन की क्षमता का एक सटीक मूल्यांकन प्रदान नहीं करते । कई एक अंडा के निषेचन के लिए अग्रणी घटनाओं के उपाय व्यक्तिगत spermatocytes7के प्रदर्शन की एक उपयुक्त प्रतिनिधित्व के लिए अनुमति देते हैं ।

पद्धति शुक्राणु समारोह को मापने के लिए विकसित मुख्य रूप से प्रजातियों विशेष है । उदाहरण के लिए, एवियन शुक्राणु में, व्यवहार्यता, गतिशीलता और IPVL के प्रवेश सबसे आम मानकों शुक्राणु गुणवत्ता8,11,12का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है । बोल पड़ना में जीने शुक्राणु की संख्या शुक्राणु के अस्तित्व के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है क्योंकि वीर्य में मृत शुक्राणु की एक बड़ी संख्या की उपस्थिति शुक्राणु की गुणवत्ता को प्रभावित करता है । इस वीर्य में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन को बढ़ाता है और जीना शुक्राणु13के लिए ऑक्सीडेटिव क्षति का कारण बनता है । शुक्राणु गतिशीलता, शरीर के तापमान पर प्रतिरोध के खिलाफ एवियन शुक्राणु के flagellar आंदोलन के लिए क्षमता, निषेचन8के बारे में लाने में एक प्रत्यक्ष भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है । यह अच्छी तरह से स्थापित है कि गतिशीलता सकारात्मक प्रजनन के साथ संबद्ध है और इसलिए,8प्रजनन क्षमता का एक प्राथमिक निर्धारक है । हालांकि, एक मोबाइल शुक्राणु भी एक एआर से गुजरना करने के लिए और IPVL11घुसना करने की क्षमता होनी चाहिए । IPVL प्रवेश परख हर शुक्राणु है कि11निषेचन की प्रक्रिया में भाग लेने के लिए खाते में ले लो ।

कला के आवेदन में, बोल पड़ना आमतौर पर उच्च गुणवत्ता वाले शुक्राणु की एकाग्रता को अधिकतम करने के लिए और कम गुणवत्ता वाले शुक्राणु की एकाग्रता को कम करने के क्रम में संसाधित है. वीर्य के संग्रह के बाद, उच्च गुणवत्ता वाले शुक्राणु के अनुपात के माध्यम से समृद्ध किया जा सकता शुक्राणु जुदाई प्रक्रियाओं आमतौर पर दोनों उद्योग और अनुसंधान प्रथाओं में इस्तेमाल किया. इन प्रक्रियाओं के कई विकसित किया गया है, सभी संबंधित लाभों और सीमाओं के साथ, लेकिन सभी शुक्राणु की विषम प्रकृति का उपयोग करने के लिए केवल उच्च निषेचन की क्षमता के साथ शुक्राणु इकट्ठा । इन प्रक्रियाओं में शामिल हैं शुक्राणु माइग्रेशन विधि, पालन स्तंभ निस्पंदन और घनत्व ग्रैडिएंट केंद्रापसारक (क्लब)14,15,16,17,18,19 , 20. उपलब्ध तकनीकों के अलावा, क्लब के लिए बहुत आसान हो पाया गया है, दोहराया, लागत प्रभावी और उच्च गुणवत्ता शुक्राणु की अधिकतम राशि अलग करने में कुशल के लक्ष्य के साथ कला में निषेचन की अधिकतम संभावना14 , 15. इसके अलावा, क्लब शुक्राणु कोशिका झिल्ली को हानिकारक नहीं है । इसके विपरीत, शुक्राणु प्रवास के तरीके केवल उत्तरोत्तर मोबाइल शुक्राणु18,19, एकत्र, लेकिन शुक्राणु की मात्रा बहुत कम है, यह18शुक्राणु की बड़ी मात्रा में इकट्ठा करने में अक्षम बना रही है, 20. पालन कॉलम निस्पंदन वीर्य17से अत्यधिक मोबाइल शुक्राणु छानने में बहुत कुशल है; हालांकि, यह शुक्राणु झिल्ली20,21के लिए हानिकारक हो जाता है ।

क्लब तकनीक में, घनत्व ढाल पैदा करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल सब्सट्रेट Percoll है, जो कोलाइडयन सिलिका polyvinylpryrolidone में लेपित कणों के होते हैं । Percoll घनत्व ढाल केंद्रापसारक (PDGC) या तो सतत या निरंतर हो सकता है, लेकिन एक सतत ढाल सबसे अधिक उच्च उपज अलगाव के लिए अत्यधिक मोबाइल शुक्राणु13,16,20के लिए इस्तेमाल किया जाता है । एक सतत ढाल में, कम घनत्व मीडिया उच्च घनत्व मीडिया के ऊपर तैरता है, एक ढाल है कि एक शंकु ट्यूब के नीचे करने के लिए ऊपर से घनत्व में बढ़ जाती है बनाने । यह अलग घनत्व के दो मीडिया के बीच इंटरफेस पर सीमाएं बनाता है । PDGC की दक्षता दो कारकों से ली गई है: 1) व्यक्तिगत शुक्राणु कोशिकाओं और 2) के उच्च संरचनात्मक अखंडता के साथ शुक्राणु कोशिकाओं की प्रवृत्ति के लिए एक वृद्धि हुई घनत्व की आवेगी क्षमता । उच्च गतिशीलता के साथ शुक्राणु बेहतर कम घनत्व मीडिया से पार और एक उच्च घनत्व मीडिया में घुसना करने में सक्षम हैं । कम गतिशीलता शुक्राणु और अलग घनत्व के मीडिया के बीच इंटरफेस के द्वारा बनाई गई सीमा पर फंस बनने की संभावना है । उच्च संरचनात्मक अखंडता और गतिशीलता के साथ शुक्राणु कोशिकाओं को मृत, असामान्य या कम मोबाइल शुक्राणु कोशिकाओं की तुलना में एक उच्च घनत्व है करते हैं । जब केंद्रापसारक बल PDGC में लागू किया जाता है, इस ढाल में अपने संबंधित जगह के लिए विभिंन घनत्व के साथ शुक्राणु की आवाजाही की सुविधा ।

सामान्य व्यवहार में, PDGC के बाद किया जाता है, शंकु ट्यूब के नीचे उच्च प्रजनन क्षमता के साथ शुक्राणु की नरम गोली एकत्र की है, और शेष छोड़ दिया जाता है । हालांकि, इस तकनीक का एक आरसीएच लाभ अपने शुक्राणु कोशिकाओं को कई समूहों में गुणवत्ता अंतर के आधार पर अलग करने की क्षमता है । अनुसंधान प्रयोजनों के लिए, PDGC तकनीक का उपयोग गुणवत्ता की डिग्री से शुक्राणु की जुदाई शुक्राणु की गुणवत्ता के अध्ययन के लिए अनुमति देता है के रूप में यह शारीरिक, metabolomic और proteomic मतभेदों से संबंधित है । यहां, हम विस्तार के उद्देश्य कैसे इस तकनीक को गुणवत्ता से शुक्राणु अलग इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही साथ गुणवत्ता में इन मतभेदों का प्रदर्शन, पहले से स्थापित eosin-nigrosin व्यवहार्यता के लिए महत्वपूर्ण धुंधला, गतिशीलता के लिए Accudenz परख, और शुक्राणु-IPVL का उपयोग penetrability के लिए बातचीत परख ।

Protocol

सभी तरीकों यहां वर्णित संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) जॉर्जिया विश्वविद्यालय के द्वारा अनुमोदित किया गया है । 1. पारंपरिक केंद्रापसारक का उपयोग कर धुलाई फॉस्फेट बफर समाधान (पंजा?…

Representative Results

PDGC तकनीक सभी मापदंडों भर में गुणवत्ता की डिग्री से शुक्राणु के तीन परतों की अलग जुदाई में हुई । शुक्राणु उच्च घनत्व समाधान, उच्च और कम घनत्व समाधान और कम घनत्व समाधान के ऊपर एक कम गुणवत्ता की…

Discussion

फर्टिलिटी न केवल पशु उत्पादन की लाभप्रदता को निर्धारित करता है बल्कि अस्तित्व के लिए प्रजातियों के प्राकृतिक चयन के साधन के रूप में भी कार्य करता है । एक शुक्राणु कोशिका के अंतिम समारोह के लिए एक डिंब ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

कोई.

Materials

Accudenz Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USA AN7050
Percoll  Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA P7828
Schiff’s reagent Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA 3952016
TES Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA T1375
Eosin Y Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA E4009
Nigrosin Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA 198285
ST 40R Centrifuge  Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 75004524
DU 530 Life Sciences UV/Vis Spectrophotometer Beckman Coulter, Brea, CA, USA No catalogue is found
Olympus IX 71 Inverted Fluorescence and Phase Contrast Microscope Olympus America Inc., PA, USA No catalogue is found

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Ahammad, M. U., Jarrell, Z. R., Benson, A. P. Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (141), e58833, doi:10.3791/58833 (2018).

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